Ultrafiltratsiooni rakendamine looduslikul kollageeni ekstraheerimisel

Kollageenil kui looduslikul valguressurssil on hea biosobivus, madal antigeensus, biolagunevus ja hemostaas, tihe spiraalne struktuur ja oma omadused, mis kõik loovad eeldused selle industrialiseerimiseks. Kollageeni ja selle kõrvalsaadusi ei kasutata mitte ainult pakkematerjalina, kosmeetika- ja tervishoiutoodetena, vaid ka toidulisanditena lihatoote täiustamiseks ning see mängib olulist rolli eelkõige meditsiinivaldkonnas.

 

Mis on kollageen?

 

Kollageen on bioloogiline makromolekul, loomse sidekoe põhikomponent ning imetajatel kõige rikkalikum ja laiemalt levinud funktsionaalne valk, mis moodustab 25–30% koguvalgust, mõnes organismis isegi kuni 80% või rohkem. See mängib loomarakkudes sidumiskoe rolli.

Mõõdetakse, et täiskasvanud inimese kehas on umbes 3 kg kollageeni, mis esineb peamiselt inimese nahas, luudes, silmades, hammastes, kõõlustes, siseorganites (sh süda, magu, sooled, veresooned) ja teistes inimkeha osades ning funktsioon on säilitada naha ja kudede ja elundite morfoloogiat ja struktuuri, samuti on see oluline tooraine erinevate kudede vigastuste järgseks paranemiseks.

 

Kollageenivalke on mitut tüüpi ja levinumad tüübid on I, II, III, V ja XI tüüp. Oma hea biosobivuse, biolagunevuse ja bioaktiivsuse tõttu on kollageeni laialdaselt kasutatud toidus, meditsiinis, koetehnoloogias, kosmeetikas ja muudes valdkondades.

Kuidas eraldada looduslikku kollageeni

Loomade ja kodulindude kuded on inimeste jaoks peamine viis loodusliku kollageeni ja selle kollageenipeptiidide saamiseks. Seoses sellega seotud loomahaiguste ja teatud usuliste veendumuste tõttu on aga inimeste kollageeni ja selle saaduste kasutamine maismaaimetajatelt piiratud ning areng on tasapisi pöördumas mereorganismide poole. Euroopa Toiduohutusamet (EFSA) on kinnitanud, et isegi loomaluudest saadud kollageenil ei ole potentsiaali nakatada hullu lehma tõbe ja muid sellega seotud haigusi. Aminohapete koostise ja ristsidumise astme erinevuste tõttu on veeloomadel, eriti kollageenil, mis on rikas nende töötlemisjäätmetes, nagu nahk, luud ja katlakivi, palju eeliseid, mida kariloomade kollageenil ei ole. Lisaks on mereloomadest saadud kollageen mõnes aspektis, nagu madal antigeensus ja hüpoallergeensus, ilmselgelt parem kui maismaaloomade kollageen. Seetõttu võib veekollageen järk-järgult asendada maismaaloomade kollageeni. Eeskujuks võeti kõrreliste soomustest kollageeni eraldamise protsess.

 

Kollageeni ekstraheerimine kõrreliste soomustest ultrafiltratsioonimeetodil

1. Materjalid ja meetodid

1.1 Katseproov

Toores kollageeni vesiekstrakt.

1.2 Katsemeetodid

1.2.1 Ultrafiltreerimisprotsessi viis

 

1.2.2 Eelfiltreerimisprotsessi määramine

Selles testis võrreldakse ja analüüsitakse vaakumfiltreerimismeetodit ja mikrofiltratsiooni meetodit, et määrata kindlaks parim filtreerimiseelne filtreerimisprotsess. Spetsiifilised katsemeetodid on järgmised:

① Kollageeni toorveeekstrakt filtreeriti filterpaberi vaakumpumbaga, et eemaldada veeekstraktist suspendeeritud osakesed ja lisandid.

② Toorkollageeni vesiekstrakt filtreeriti 0,2 μm mikrofiltratsioonimembraaniga, et eemaldada vesiekstraktist lahustumatu aine ja lisandid.

 

1.2.3 Ultrafiltratsioonimembraani pooride suuruse valik

Ultrafiltratsioonimembraani pooride suurus oli 100 kDa.

 

1.2.4 Ultrafiltratsioonipuhastusprotsessi ühe teguri katse

Toorkollageeni vesiekstrakti puhastamiseks kasutati ultrafiltratsiooni tehnoloogiat ning uuriti ühefaktorilisi katseid töörõhu, töötemperatuuri ja pH väärtuse mõju kohta kollageeni retentsioonile. Pärast ultrafiltreerimisseadmete teatud aja käivitamist ja stabiliseerumist uuriti erinevate tegurite mõju kollageeni retentsioonile.

 

1.2.5 Arvutusvalem

 

2. Tulemused ja analüüs

2.1 Eelfiltreerimisprotsessi analüüsi tulemused

Kahe vaakumekstraktsiooni ja mikrofiltratsiooni filtreerimismeetodi võrdlustulemused on toodud järgmises tabelis.

 

Tabelist on näha, et nii vaakumfiltreerimismeetodil kui ka mikrofiltratsioonimeetodil saab lahusest eemaldada lisandeid ja lahustumatud tahkeid aineid, kuid mikrofiltratsioonimeetodil on valke parem kaitsva toimega ehk kadu ei ole ilmselge ning vaakumfiltreerimismeetod on lihtne põhjustada valkude kadu. Lisaks sellele ilmneb vaakumfiltreerimismeetodil pärast filtraadi teatud perioodi asetamist hägusust ning mikrofiltraat on endiselt selge ja läbipaistev, seega valitakse mikrofiltreerimine ultrafiltrimise eeltöötlusprotsessiks.

 

2.2 Ultrafiltratsiooniprotsessi ühe teguri test

2.2.1 Ultrafiltratsiooni rõhu mõju retentsioonikiirusele

Temperatuuri 40 kraadi ja pH=9.0 tingimustes erinevate ultrafiltratsioonirõhkude mõju (0.07MPa, {{9} }.09 MPa, 0,11 MPa, 0,13 MPa ja 0,15 MPa) uuriti valgupeetust. Tulemused on näidatud alloleval joonisel.

Nagu ülaltoodud jooniselt näha, väheneb töörõhu suurenemisega valgu peetuse määr järk-järgult. Kui töörõhk on {{0}}.07 MPa, on valgu peetumismäär 96,53% ja kui töörõhk on 0,15 MPa, on valgu peetumismäär 84,38%. Selle põhjuseks on asjaolu, et ultrafiltratsiooni eraldusmõju ainetele toimub rõhuerinevuse kaudu. Madala töörõhu vahemikus võivad väikesed molekulid membraani kiiresti läbida, samas kui suured molekulid võivad ultrafiltratsioonimembraani kinni jääda ja koguneda membraani pinnale. Sel ajal moodustavad membraani pind ja veeekstrakt kontsentratsiooni erinevuse, mille tulemuseks on kontsentratsiooni polarisatsioonitakistus. Praegu on rõhk suhteliselt madal ja see ei saa retentsioonimäära oluliselt mõjutada. Kuid rõhu tõusuga suureneb kontsentratsiooni polarisatsioonitakistus järk-järgult ning membraani pinna ja veeekstrakti kontsentratsiooni erinevus saavutab tasakaalu. Kui rõhk ületab selle tasakaalu, võib membraani pinnale moodustuda geelikiht (mis on kooskõlas teooriaga, et ultrafiltrimise käigus moodustuvad kontsentreeritud polarisatsioon ja kondensatsioonikiht) ning rõhk kasvab jätkuvalt, geelikihi paksus suureneb. ja suureneb ka membraani pinnale jääv valk. Selle tulemuseks on madalam kinnipidamismäär. Membraani eraldusefekti tagamiseks on töörõhu optimaalne parameeter 0,07 MPa.

 

2.2.2 Temperatuuri mõju valkude säilimisele

Rõhu {{0}},11 MPa ja pH=9,0 tingimustes on erinevate temperatuuride, nimelt 25 kraadi , 30 kraadi , 35 kraadi , 40 kraadi ja 45 kraadi mõju valkudele säilitamist uuriti. Tulemused on näidatud alloleval joonisel.

Nagu ülaltoodud jooniselt näha, suureneb ultrafiltratsioonimembraani retentsioonimäär järk-järgult temperatuuri tõustes ja saavutab maksimumi 45 kraadi juures, retentsioonimääraga 97,01%. Seda seetõttu, et kollageeni viskoossus on tihedalt seotud temperatuuriga. Kui temperatuur on madal, on kollageeni viskoossus suurem ja kollageeni kogunemine membraani pinnale on kergesti vastupanu tekitamiseks, mille tulemuseks on madal retentsioonimäär. Kui temperatuur tõuseb, kollageeni viskoossus väheneb, kollageenimolekulide vaheline interaktsioon nõrgeneb ja massiülekande kiirus suureneb, kontsentratsiooni polarisatsiooninähtus nõrgeneb ja retentsioonimäär suureneb. Teine peetumiskiiruse suurenemise põhjus on see, et temperatuur tõuseb, kollageeni lahustuvus suureneb vastavalt ja kollageeni membraani blokeerimise nähtus väheneb, seega on ultrafiltrimise optimaalne temperatuur 45 kraadi.

 

2.2.3 PH väärtuse mõju valgupeetusele

Rõhu {{0},11 MPa ja 40 kraadise temperatuuri tingimustes on erinevate pH tingimuste, nimelt pH=6.0, pH{{ 5}}.{{10}}, pH=8,0, pH=9,0 ja pH=10,0, retentsioonimäära kohta. Tulemused on näidatud alloleval joonisel.

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>7, retentsioonimäär suureneb järk-järgult pH väärtuse suurenemisega. Seda seetõttu, et ultrafiltratsioonimembraan on negatiivse laenguga polüeetervahtra membraan ja kollageen on leeliselistes tingimustes negatiivselt laetud. Negatiivselt laetud kollageenimolekulid moodustavad ultrafiltratsioonimembraaniga üksteist välistava oleku sama laenguga, mistõttu kollageenimolekulidel ei ole kerge membraani pinnal püsida ja membraani blokeerida. Seetõttu on ultrafiltrimise optimaalne pH väärtus 8-10.

 

2.3 Ultrafiltratsiooni protsessi optimeerimine ja tulemuste kontrollimine

Tarkvara Design-Expert8.05 analüüsi järgi on optimaalsed protsessiparameetrid: töörõhk 0,14 MPa, töötemperatuur 40,98 kraadi , lahuse pH{{7 }}.43 ja kinnipidamismäär on 92,551%. Arvestades tegelike parameetrite toimivust, valiti ultrafiltrimise tingimusteks töörõhk 0,14 MPa, töötemperatuur 40 kraadi ja materjalilahuse pH väärtus 9,50 ning katsekontrolliga alustati pärast ultrafiltreerimissüsteemi käivitamist ja stabiliseerimist. Retentsioonimäära tulemus oli (92,61±0,1) % (n=3). Võrrandi prognoositavad väärtused on põhimõtteliselt sarnased mõõdetud väärtustega, mis näitab, et prognoositud seisundiparameetrite tulemused on kooskõlas tegelike seisunditulemustega.

 

2.4 Elektroforeetilise analüüsi tulemused

Puhastatud kollageeni analüüsiti SDS-PAGE elektroforeesiga ja tulemused on näidatud järgmisel joonisel.

 

Nagu ülaltoodud jooniselt näha, on rada 1 selle testi puhastatud kollageen ja rada 2 on vasika kõõluse standardne kollageeniproov. SDS-PAGE elektroforeesist on näha, et selles uuringus võib kollageeni identifitseerida kollageenina, kuid piirid a1 peptiidahela ja a2 peptiidahela vahel ei tundu olevat selged. Elektroforeetiliselt kaardilt on näha, et muud valgulisandit pole, seega võib järeldada, et puhastatud kollageen on kõrge puhtusastmega.

Guidlingi kohta

 

Guidling Technology on riiklik kõrgtehnoloogiline ettevõte, mis keskendub biofarmatseutikatele, rakukultuurile, biomeditsiini puhastamisele ja kontsentreerimisele, diagnostikale ja tööstuslikele vedelikele. Oleme edukalt välja töötanud tsentrifugaalfiltriseadmed, ultrafiltreerimis- ja mikrofiltreerimiskassetid, viirusfiltrid, TFF-süsteemid, sügavusfiltrid, õõneskiud jne. Mis vastavad täielikult biofarmatseutiliste preparaatide, rakukultuuri jne rakendusstsenaariumidele. Meie membraane ja membraanfiltreid kasutatakse laialdaselt eelfiltreerimise, mikrofiltreerimise, ultrafiltratsiooni ja nanofiltratsiooni kontsentreerimiseks, ekstraheerimiseks ja eraldamiseks. Meie paljud tootesarjad, alates väikesest ühekordselt kasutatavast laboratoorsest filtreerimisest kuni tootmise filtreerimissüsteemide, steriilsuse testimise, kääritamise, rakukultuuri ja muuni, vastavad testimise ja tootmise vajadustele. Guidling Technology ootab teiega koostööd!