Kuidas valida sobiv ultrafiltratsioonitoru
Ultrafiltratsioonitorudes kasutatakse sageli valgu kontsentreerimiseks ja puhvri asendamiseks tavaliselt kasutatavaid ultrafiltratsioonitorusid. On ka teisi mudeleid, millel on erinev maht ja ultrafiltratsioonitorud, olenevalt sihtvalgu molekulmassist, mahust enne kontsentreerimist ja kontsentratsiooni sihtmahust. Korduvkasutatav.
1. Valige sobiv ultrafiltratsioonitoru, arvestades peamiselt MWCO-d ja kontsentratsiooni mahtu. Üldiselt ei tohiks molekulmass olla suurem kui 1/3 sihtvalgu molekulmassist. Kui sihtvalgu molekulmass on umbes 10 kd, võib kasutada ultrafiltratsioonitoru, mille molekulmass on säilinud 3 KD.
2. Äsja ostetud ultrafiltratsioon on kuiv. Enne kasutamist lisage milliq vett. Vesi läbib täielikult membraani ja eeljahutatakse jäävannis või külmikus mõneks minutiks. Seejärel valage valgulahuse lisamiseks vesi välja. Valgulahuse kogus ei tohi ületada valget joont katseklaasi ülaosas. Lihtne töö. Enne valgulahuse lisamist tuleb ultrafiltratsioonitoru eeljahutamiseks jäässe sisestada.
3. Tasakaal. Mass ja raskuskese peavad olema tasakaalus. Pange tähele, et kiirus ja kiirendus ei tohiks olla liiga kiired, vastasel juhul saab ultrafiltratsioonimembraan otseselt kahjustada. Käivitage tsentrifugaalne ultrafiltreerimine (tsentrifuugi eeljahutamine 4 kraadini). Membraani ja pöörleva võlli suunda saab reguleerida vastavalt juhistele (nurktsentrifuugi puhul on membraan võlliga risti). Tegelikul kasutamisel on üldine kiirus väiksem kui juhendis ette nähtud, mis võib pikendada tsentrifugaaltoru kasutusiga.
4. Kui kontsentreeritakse ülejäänud 1 ml-ni, [võtke 50 ul Bradfordi majapidamislahust, lisage 10 ul vedelikku, et näha, kas see muutub siniseks, ja tehke kindlaks, kas ultrafiltratsioonitoru lekib valku. Kui toru lekib, valage see ülemisse kihti ja seejärel voolake tagasi uude torusse, et alustada ultrafiltreerimist. Katseklaasi lekke täpseks kindlakstegemiseks tsentrifuugige 5 mg 10 minutit 10 minutit, seejärel laske see läbi, käivitage valgugeel või Bradford] [jäme mõõtmine]. Jätkake ülejäänud valgulahuse lisamist kontsentreerimiseks (töötage jääl, et vältida valgu kuumenemist), kuni kõik kontsentreeritud lahused on lisatud. Tsentrifuugimise ajal pöörake tähelepanu sellele, kas valgu sadestumine toimub ja põhjustab toru ummistumist. Sademete ilmnemisel tehke kindlaks sademete konkreetne põhjus, kas valgu kontsentratsioon on liiga kõrge või kas puhver on sobimatu; Esimest saab lahendada, kasutades kontsentratsiooni vähendamiseks korraga mitut ultrafiltratsioonitoru, samas kui teine võib muuta erinevaid puhvreid, kuni valk sadestub.
5. Eelnevaid samme kasutatakse valgu kontsentreerimiseks. Kui puhver tuleb välja vahetada, kui kogu valgulahus on kontsentreeritud umbes 1 ml-ni, lisage ettevaatlikult uus puhver (ultrafiltreerimine läbi 0,22 um ultrafiltratsioonimembraani) ja seejärel kontsentreerige kolm korda pidevalt umbes 1 ml-ni, nii et et lõppkontsentratsioon sõltub nõutavast valgukontsentratsioonist, mis tavaliselt ei ole suurem kui 500ul või alla 200ul. Iga kord vähemalt 10-kordse mahukontsentratsiooni järgi on see rohkem kui 1000 korda suurem kui kolm korda, mis võib põhimõtteliselt saavutada puhvri muutmise eesmärgi.
6. Eemaldage lõplik valgukontsentraat. Töötage jääl. Kollase pipeti otsaga (200 ul) sisestage pipetiots õrnalt piki serva, seejärel puhuge õrnalt ja segage valgulahust. Olge ettevaatlik, et te ei puudutaks ultrafiltreerimismembraani. Imege kontsentreeritud lahust iga kord 200 ul-ni, kuni see on täielikult imetud. Katseklaasi põhjast ei ole vaja viimast kontsentreeritud lahust ekstraheerida, vastasel juhul on see liiga raske ja ultrafiltratsioonimembraan võib kahjustuda. Lõpuks lisatakse ultrafiltratsioonitorusse milliq vett ilma ultrafiltratsioonimembraani läbimata, et vältida veekadu ja membraani kuivamist.
7. Ultrafiltratsioonitoru töötlemise ja ultrafiltratsioonitoru taaskasutamise etapid on järgmised.
8. Valage ultrafiltratsioonitorusse vesi ja loputage mitu korda õrnalt milliq veega. [kui katseklaasi põhjas on ilmne valgu sadenemine, võite esmalt lisada vett ja seejärel pipetiga ära puhuda. Olge ettevaatlik, et te ei puudutaks membraani. Sade ripub alla ja jookseb siis minema. Te ei saa seda kraaniveega loputada. Pärast 0,2 m NaOH lahuse lisamist asetage see 20 minutiks toatemperatuurile ja tasakaalustage ultrafiltratsioonitoru selle aja jooksul. Tsentrifuugige veel 10 minutit. Valage järelejäänud NaOH lahus ja kastke puuvillane südamik keeduklaasi (1 või 2L) Milliq vette, asetage see mitmeks tunniks ja seejärel asendage see uue veega, mis asetatakse mitmeks tunniks, et NaOH kontsentratsiooni pidevalt lahjendada. Peske 50 ml katseklaasi ja katke kraaniveega ning peske sisesein milliq veega.
9. Võtke välja sukeldatud katseklaasi südamik, lisage see täis milliq veele ja seejärel täitke 50 ml katseklaas milliq veega. Pange toru südamik aeglaselt 50 ml-sse.
Tsentrifuugige toru, tühjendage ja jagage vesi, seejärel katke kinni ja hoidke kuni järgmise kasutamiseni 4 kraadi juures. Üldiselt võib öelda, et ülaltoodud sammude ja ettevaatusabinõude kohaselt ei purune iga toru kolme või nelja aasta jooksul.
