Kirjanduse osa|Öelge keerulise puhastusega hüvasti? Uudne TFF + pindaktiivse aine meetod parandab tõhusust ja vähendab AAV -vektori tootmise kulusid

Geeniteraapia areneb kiiresti, kuid selle kõrge hind on endiselt peamine takistus, mis takistab patsiendi laiemat juurdepääsu. Selle kulude peamiste draiverite hulgas on Adeno - Associated Virus (AAV) vektorite keeruline tootmisprotsess. Biotehnoloogias ja biotehnoloogias avaldatud uuring on välja töötanud uudse puhastusmeetodi, mis ühendab tangentsiaalse voo filtreerimise (TFF) pindaktiivsete ainetega, mis lubab lihtsustada AAV -i puhastusprotsessi ja vähendada kulusid. Uurime seda uurimistööd Tokyo ülikooli meeskonna juhitud uurimistöösse.

 

1. uurimistöö taust: AAV -i puhastamise väljakutsed ja hetkeseisund

AAV -vektorid on saanud geeniteraapias "Star" kohaletoimetamise tööriistad tänu oma kõrgele ohutusele, madalale immunogeensusele, võimele nakatada nii jagamist kui ka mitte - jagunevaid rakke ja võime pikka - terminit geeniekspressioon. Kuid nende tootmisprotsess on keeruline, eriti allavoolu puhastamise etapid, mis hõlmavad tavaliselt mitut tsentrifuugimise ja kromatograafia vooru. Need meetodid on aeg - tarbivad, tööjõu - intensiivne, raskesti skaleeritav ja kulukas.

Labori skaalal tugineb puhastamine sageli tseesiumkloriidi või joduxanooli tiheduse gradiendi ultratsentrifuugimisele, mida on keeruline tööstusliku tootmise jaoks keeruline. Üha enam kasutatakse afiinsuskromatograafiat, kuid madalad pH elueerimistingimused, mida see nõuab, võivad kahjustada viiruse nakkavust. Seetõttu on kriitiline lihtsa, tõhusa, õrna ja skaleeritava AAV -puhastusmeetodi väljatöötamine.

Tangentsiaalse voo filtreerimine (TFF) on suurus - põhineb eraldamise tehnika, mida tavaliselt kasutatakse kontsentreerimiseks ja puhverdamiseks - bioproduktide vahetamiseks. Kuid tavapärasel TFF -il on piiratud võime eemaldada sellised lisandid nagu peremeesraku valgud (HCP) ja DNA AAV -i puhastamise ajal, jättes sageli valgu agregaadid maha.

 

2. Uuenduslik lähenemisviis: TFF koos pindaktiivsete ainetega tõhusaks puhastamiseks

Traditsiooniliste TFF -i piirangute ületamiseks töötasid teadlased Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa ja Tokyo ülikooli kolleegid välja nutika strateegia: Pindaktiivsete ainete kasutamine põimimiseks lisandvalkude agregatsiooni ja interaktsioonide pärssimiseks, võimaldades neil TFF -i ultrafiltretion -massil läbi viia (500 KDA molekulist) (500 KDA molekulist) suurus).

Nad testisid kolme tüüpi pindaktiivseid aineid:

• Non - ionic:Octyl glükosiid
• Anioonne:Naatriumdoksükolaat
• Zwitterionic:Põrnad

Uuringus leiti, et mitte - ioonpindaktiivse aine kasutamine ainult oli ebaefektiivne. Nii anioonse naatriumdeoksükolaadi kui ka zwitterioonsed põrnad suurendasid märkimisväärselt jääkvalkude eemaldamist ja nad olid suunatud erinevatele valgupopulatsioonidele. Lõppkokkuvõttes andis 0,5% naatriumdoksükolaadi 1% -lise põrkega ühendamine märkimisväärsed tulemused, kõrvaldades peaaegu täielikult peremeesorganismi jääkvalgud. SDS - lehe analüüs näitas ainult kolme selget AAV kapsiidi valguriba (VP1/VP2/VP3).

 

Joonis 1. TFF puhastusprotsess ilma pindaktiivsete aineteta;(a) sds - lehe geeli elektroforees; (b) Käigukasti elektronmikroskoopia (TEM)

 

Joonis 1. TFF -i puhastamise protsess pindaktiivsete ainetega;(a) SDS - lehe geeli elektroforees; (b) Käigukasti elektronmikroskoopia (TEM)

 

3. Uurimistulemused: suur puhtus, aktiivsus ja ohutus

1. Tõhus lisandite eemaldamine:Uus meetod saavutas HCP -de eemaldamise 99,98% ja DNA eemaldamise 95%, puhtus on võrreldav afiinsuskromatograafiaga või ületab seda.
2. Parem nakkavus:In vitro katsed näitasid, et AAV1 vektorid puhastasid selle meetodi abil nakatusid HEK293 rakke tõhusamalt kui afiinsuskromatograafia abil puhastatud (24,9% vs 20,8%), mis näitab viiruse bioaktiivsuse paremat säilitamist.
3. Hea in vivo ohutus:Pärast puhastatud AAV1 vektorite lokaalset süstimist hiire skeletilihastesse ei täheldatud kahe nädala pärast olulist põletikku ega kudede kahjustusi, mis näitavad head in vivo ohutust.
4. Lai serotüübi rakendatavus:Meetod puhastas edukalt mitu serotüüpi -, sealhulgas AAV1, AAV5, AAV8 ja AAV9 rakukultuuri supernatantidest. Kuid AAV2 puhul, mis eksisteerib peamiselt suure lisandite koormusega rakulüsaatidel, on vaja täiendavat optimeerimist.

 

4. kokkuvõte ja väljavaade

Selle uuringu välja töötas lihtne, kiire (1,5 tundi), tõhus ja skaleeritav uus AAV -puhastusprotsess. Ühendades naatriumdoksükolaadi ja põrke, käsitles see edukalt valkude agregatsiooni väljakutset TFF -i puhastamise ajal.

Meetodi eelised hõlmavad järgmist:

• Karmide madala pH tingimuste vältimine, viiruse aktiivsuse paremini säilitamine
• Kromatograafia sammude vähendamine, töövoo lihtsustamine ning aja ja kulude säästmine
• Kergesti skaleeritav, sobiv tööstuslikuks suureks - skaala tootmiseks
• Pakkudes uue strateegia teiste biomakromolekulide, näiteks eksosoomide, muude viiruste ja rekombinantsete antikehade puhastamiseks

Praegused piirangud hõlmavad viiruse suboptimaalset taastumist ja suutmatust eraldada tühjade kapsiide täisviirusosakestest, mis viitab selle parima kasutamise, võib olla esimene - astme jäädvustamine mitme {- astme puhastamise töövoog.

Kokkuvõtteks võib öelda, et see uurimistöö pakub AAV -vektorite tootmiseks atraktiivset uut võimalust ja sellel on potentsiaal geeniteraapia ravimite kulusid märkimisväärselt vähendada, hõlbustades nende laiemat kasutamist.