Membraanitehnoloogia ja vaktsiini selgitamine (Ⅱ)
Eelmises artiklis tutvustasime vaktsiine ja vaktsiinide selgitamise strateegiaid ning jätkame nende uurimist käesoleva artikli ülejäänud osas. Eespool öeldut järgides jätkame vaktsiiniselgituste ja sellega seotud membraanikoe rakenduste jagamist.
2.2.2 Viiruse füüsikaliste ja keemiliste omaduste mõju
Pärast tootmissüsteemi ja asjakohaste saasteainete eemaldamise meetodite kaalumist selgitamise etapis on oluline võtta arvesse viiruse omadusi ja keskenduda viiruse saagise maksimeerimisele.
2.2.2.1 Lihtne viiruse adsorptsioon
Sügava filtreerimise efektide parandamiseks on välja töötatud positiivselt laetud materjalid ja filtri abivahendid (nt diatomiit). Kuigi positiivne laeng suurendab nukleiinhapete ja HCP sidumist, seob diatomiit teadaolevalt rakujääke ja kolloide. Kuid need materjalid võivad adsorptsioonimehhanismi kaudu viirust ka säilitada. Kuna viirus on lahuses tavaliselt negatiivselt laetud, võib positiivselt laetud filtriga tekkida elektrostaatiline interaktsioon.
Viirused võivad seonduda ka hüdrofoobse või mittespetsiifilise interaktsiooni kaudu teatud filtrimaterjalidega (nt diatomiit või klaaskiud). Ümbrisega viirused on oma lipiidide ümbrise tõttu sellele adsorptsioonile vastuvõtlikumad. Kui viirus adsorbeerub filtrile elektrostaatiliste interaktsioonide kaudu ja viiruseosakesed eralduvad soolakonkurentsi tõttu, võib filtri loputamine kõrge juhtivusega puhvriga viiruse osaliselt taastada. Kuid see võib elueerida ka saasteaineid, nagu HCP või nukleiinhapped. Seetõttu on eelistatud alternatiivse filtrimaterjali, näiteks inertsema polüpropüleeni kasutamine.
Adenovirus is easily adsorbed, but different results have been confirmed. Using positively charged diatomite and deep filters. Borosilicate glass fiber filter material is also very well recovered. On the other hand, a patent proposed by Weggeman involving clarification of 20 – 40% adenovirus losses at PER, et al. Cell cultures were prepared with similarly positively charged deep filters containing diatomite. In this case, the nominal polypropylene filter showed a very high viral recovery rate (> 90%).
On hästi teada, et gripiviirused on selitamise ajal kalduvad adsorptsiooni kaduma. Seetõttu sobib gripikogumi puhastamiseks tasuta filtri, polüpropüleenil põhineva filtri kasutamine. Thompson jt teatasid nimiväärtusega 1,2 μm polüpropüleenfiltri kasutamisest, millele järgnes 0,45 μm PVDF membraan, et selgitada rakupõhist gripiviirust, mida toodavad MDCK rakud. Kokku viidi läbi üheksa puhastuskatset 20L skaalal, laadides 1,2 μm polüpropüleenfiltri puhul 111 l / m2 ja 0,45 μm PVDF filtri puhul 105 l / m2. Tulemused näitasid, et enamik jooksvaid viirusi taastus hästi (78-154%). Nad teatasid ka kuni 58% hcDNA eemaldamisest, kuid mitte olulist HCP eemaldamist.
2.2.2.2 Tundlike viiruste lõikamine
Mõnedel viirustel (kapseldatud või kapseldamata) on madal mehaaniline vastupidavus ja need võivad tsentrifuugimise ja membraanfiltrimise käigus nihkega kokkupuutel hävida. Filtreerimist või kromatograafiat hõlmavate puhastamisetappide käigus tekkivad lõikejõud võivad põhjustada viiruse ümbrise mahakukkumist, mõjutades seega nakkavust. Sõltuvalt kapsiidi suurusest, paksusest ja geomeetriast võib viiruslik kapsiid olla rabe või vastupidi, vastupidav kõrgele rõhule. Mõned ümbrisega viirused, näiteks gripiviirused, on mehaanilise pinge suhtes elastsed ja taluvad suuri deformatsioone. Teisest küljest võib nihkejõud põhjustada vähem resistentsete viiruste (nt retroviiruste) ümbrise mahakukkumist, mõjutades seega viiruse nakkavust.
Ka rakuvälise genereeritud ümbriku VLP-d on väga haavatavad. Suured nihkekiirused tekivad tsentrifugaalprotsessis, peamiselt sisse- ja väljalaskeosades (suured nihkekiirused tekivad gaasi-vedeliku liidesel). Kui viirus puhastati gradienttsentrifuugimisega, nõrgenes mõne retroviiruse transduktsioonivõime oluliselt. Tsentrifugaaleralduse kavandamisel tuleb arvestada viiruseosakeste suhtelist ebastabiilsust nihkejõudude suhtes. Tsentrifugaaljõud ei ole ainus nihkelöögi allikas, olulisem on seadmete disain, eriti impordil ja ekspordil on ka märkimisväärne nihkešokk. Erinevate skaalade disaini erinevused võivad põhjustada erinevusi nihketundlike viiruste saagikuses ja taastumises erinevatel skaaladel.
Nihketundlikud viirused tuleks hoolikalt kavandada, kuna nihkepinge suurus ja (retsirkulatsioonist tingitud) pingega kokkupuute aeg võivad olla suured. Nihketundlike viiruste puhul eelistatakse avatud ahelaga seadmeid (õõneskiud või avatud plaadiga seadmed), et vähendada turbulentsi ja nihkejõude toitekanalis.
Tööparameetrite valik peaks samuti minimeerima viiruseosakeste kahjustusi: madal ristvool, keskmine transmembraanne rõhk (TMP) ja lühike töötlemisaeg.
Membraani saastumine kõrge rõhu all põhjustab viiruse nakkavuse kadumise, mis võib olla tingitud jõududest, mis võivad viiruse ümbrist mõjutada. Membraanipõhine eraldamine põhineb suurusel ning suure molekulmassiga viiruse inhibiitorite ja viirusosakeste kogunemine võib vähendada viirusvektorite nakkavust.
Nihketundlike viiruste lagunemist süvafiltreerimise ajal ei ole laialdaselt dokumenteeritud. Viiruste kadu süvafiltreerimisel on enamasti tingitud toote püüdmisest, adsorptsioonist või ajast ja temperatuurist sõltuvast viiruse lagunemisest. Tegelikult, kuigi NFF-süsteemides võib esineda mehaaniline pinge, on NFF-toodete kokkupuuteaeg nihkega võrreldes teiste tehnoloogiatega väga lühike, kuna NFF-i toodete puhul kogetakse kiiret ühekordset läbimist.
2.2.2.3 Lõikamine vastavalt ava suurusele
Viirusi laiusega üle 100 nm saab kinni hoida, eemaldades mükoplasma või steriilsed membraanid (0,22 μm ja alla selle). Sel juhul tuleks erilist tähelepanu pöörata filtrite valikule. TFF-i mikrofiltreerimise etappide jaoks on heade tootekanalite jaoks eelistatud 0,45 μm või 0,65 μm membraanid. NFF-i mitmeastmelise filtreerimise korral on kõige tihedam kiht 0,45 μm või suurem. Sügavfiltri valimisel tuleb olla ettevaatlik, kuna mõned süvafiltriseadmed võivad sisaldada kilekihti, mille tulemuseks võib olla toote kadu kinnihoidmise tõttu. Viiruse agregatsioon mõjutab negatiivselt viiruse tootmist ja suurendab viiruse retentsiooni tänu viiruse suurusele.
Andre ja Champluvieri patendi kohaselt võib homogeniseerimine ära hoida või piirata filtri ummistumist, vähendades täitematerjali suurust, tagades suurema saagise. Homogeniseerimine parandas ka saagi filtreerimisvõimet, mis suurenes 24-3 korda.
Liiga palju lisandeid võib takistada viiruse taastumist. Lisandid kipuvad filtrit ummistama ja ummistunud membraanipoorid võivad vähendada viiruse läbilaskevõimet. De Vochti ja Veenstra patendis on mainitud, et kõrge rakutiheduse Per. Kogumine TFF-iga ({{0}}.65 või 0.2 μm membraan) andis tulemuseks adenoviirusevaba viiruse taastumise. Taastamise saab saavutada peremeesraku DNA selektiivse sademe eemaldamisega enne 0, 65 μm TFF etappi. 70% adenoviirustest.
2.3 Juhtumiuuring: viirusvaktsiini selgitamise optimeerimine
2011. aasta rahvusvahelisel bioloogiliste protsesside konverentsil tutvustas Sanofi Pasteur ratsionaalset lähenemist filtrite sõelumisele, et töötada välja uued selgitatud järjestused kandidaatviiruse vaktsiinide jaoks. Uurimistöö eesmärk on ületada raku- ja viiruskultuuri protsesside optimeerimise probleemid. Ülesvoolu protsessi muudatused põhjustasid 20% saagise kadu ja filtri enneaegse saastumise selgitamisetapi ajal, mille tulemuseks oli mastaabi suurenemine. Tugeva ja skaleeritava selgitamisetapi loomiseks oli vaja filtrijärjestuse täielikku uuesti väljatöötamist, viiruse taastumise määraga üle 85%.
Based on internal experience and scientific publications, the team selected 27 filters for an initial screening study. Small scale virus adsorption tests were performed on various filter media (polypropylene, nylon, cellulose ester, glass fiber, charged adsorption filter) and structures (pleated or deep filter). The virus yield was measured by ELISA and the clarifying efficiency of the preselected filtrate was compared by checking the reduction of turbidity. Preliminary screening studies showed that nylon and charged filters retained viral particles and virus recovery. Ten percent. The virus recovery rate of polypropylene and polyether sulfone filter was >. 80%. Tselluloosester- ja klaaskiudfiltrite taastumismäär sõltub filtri hinnangust (20% või 90%).
Teise sammuna hindas Sanofi Pasteur sõeluuringus eelvalitud seitsme filtri mitut kombinatsiooni (faasi 2 või 3 järjestused). Püsivoolu klassifikatsiooni test viidi läbi väikese filtriga. Lisaks kasutati selles katses suuremat saagist kui sõeluuring. Viiruse taastumise ja filtrimahu tulemuste põhjal valis meeskond edasiseks uurimiseks kaks parimat kombinatsiooni.
- 1. järjestus (2. etapp): 30 μm nimiväärtusega volditud polüpropüleenist eelfilter, millele järgneb tselluloosestrist ja klaaskiust mitmekihiline liitfilter (poorsus 1/0,5 μm)
- Jada 2 (etapp 3): sama eelfilter (30 μm nimiväärtusega polüpropüleenfilter), millele järgneb vahepealne mitmekihiline polüpropüleenfilter ja lõpuks asümmeetriline polüeetersulfoonkile.
The robustness of these two clarified sequences has been challenged by repeated constant flow sizing experiments with different harvest batches. While both potential sequences demonstrated enhanced capabilities compared to the reference sequence, only sequence 1 achieved virus recovery objectives (>85%), nagu on näidatud joonisel 1.
Joonis 1 Keskmine viiruse taastumine igal filtreerimisetapil. Stabiilsusuuringuid hinnati kolme filtreerimisjärjestuse jaoks, millest ainult järjestus 1, kasutades 30 μm nominaalset volditud polüpropüleeni ja 10/0,5 μm tselluloosi estrit ja klaaskiudfiltrit, vastas üldisele taaskasutamise eesmärgile. .
Tsentrifuugimist hinnati ka esmaseks selgitamisetapiks, millele järgnes lõplik filtreerimine {{0}},45 μm. Katsetati mitut kiiruse/kestuse paari. Kuigi filtreerimiskiirust 0,45 μm suurendati kaks korda, oli lõplik saagis madalam kui sihtväärtus 85%. Seetõttu ei ole tsentrifuugimist rohkem uuritud.
Lõpuks hinnati polüpropüleeni ja klaaskiu filtreerimisjärjestuste jõudlust suuremal skaalal (160 l bioreaktori suurus). Filtrite järjestus on näidatud joonisel 2.
Joonis 2 Selgitab filtrikombinatsiooni ja stringi astmelise saagikuse graafilist esitust. Rong A on traditsiooniline protsess ja rong B on optimeeritud protsess. Optimeeritud järjestus B võib vähendada eelfiltreerimisala 3 korda, tühistada vahepealse filtreerimisetapi ja vähendada lõplikku filtreerimisala 10 korda, suurendades seega globaalset viiruse taastumist 3%.
Mitmed partiid puhastati edukalt, ilma filtri ummistumise tunnusteta, tootmispiirangutele vastav töötlemisaeg ja viiruse saagis > 85 protsenti. Selgitamisetapi optimeerimine ei mõjutanud vaktsiini järgnevaid etappe ega peamisi kvaliteediatribuute. Seetõttu kasutati vaktsiini tootmisprotsessis (1000 L suuruses bioreaktoris) valitud puhastusjärjestust ja toimivus kinnitati edukalt.
03 Bakteriaalsete vaktsiinide selgitamine
3.1 Kaalutlused bakteriaalsete vaktsiinide selgitamiseks
Meditsiinilise tesauruse (2015) kohaselt on bakteriaalne vaktsiin defineeritud kui lahjendatud või tapetud bakterite või nende antigeensete derivaatide suspensioon, mida kasutatakse immuunvastuse esilekutsumiseks bakteriaalsete haiguste ennetamiseks või raviks. Üldisemalt võib bakteriaalsed vaktsiinid aktiivse antigeeni tüübi alusel jagada nelja alamkategooriasse. See agent võib olla:
- tapab või nõrgestab terveid elusaid baktereid. Tuntud ka kui BCG vaktsiin.
- Antigeensete determinantide puhastamine (subühikvaktsiinid). Siberi katku vaktsiin või atsellulaarne läkaköha vaktsiin.
- Bakteriaalsed toksiinid (toksoidid). Difteeria ja teetanuse toksoidid.
- Plasmiid (pDNA).
Perekonna toodete laiaulatusliku heterogeensuse tõttu sõltuvad protsessi üles- ja järelprobleemid suuresti toodetava vaktsiini tüübist. Seetõttu saab pärast esialgset kääritamisetappi puhastada või mitte puhastada, nii et selitamisetappi saab läbi viia.
3.2 Bakteriaalse vaktsiini selgitamise strateegia
3.2.1 Toksoid
Kaks levinumat vaktsiini kasutamiseks toodetud toksoidi on difteeria ja teetanus, mida toodavad vastavalt Corynebacterium diphtheriae ja Clostridium tetani. Mõlema vaktsiini tootmisel kehtivad ranged regulatiivsed nõuded. WHO tehniline aruanne ja selle lisad annavad selged soovitused teetanuse ja difteeria vaktsiinide kvaliteedi, ohutuse ja tõhususe tagamiseks. Mõlema vaktsiini tootmisel kehtivad üldised head tootmistavad ning töötajad peavad olema korralikult koolitatud ja saama mõlema haiguse vastu revaktsineerimise.
GMP nõuab rangelt, et lõpptoote puhtust ja kvaliteeti tuleb tõendada. Vastavalt WHO ja EP andmetele tuleb lõpliku teetanuse vaktsiini tõhusus määrata, võrreldes seda in vivo või mõne muu tõestatud meetodiga sobiva võrdlusainega, mis on kalibreeritud rahvusvahelistes ühikutes vastavalt teetanuse toksoidi rahvusvahelisele standardile. Tõhususe uuendatud nõuded avaldati 2011. aastal ja need võivad olenevalt hindamismeetodist erineda. Samuti tuleb tõendada iga vaktsiinipartii ohutust (toksiinivaba ja taastav toksilisus). Lõpuks tuleb käsitleda vaktsiinide stabiilsust, eriti reaalajas.
3.2.2 Plasmiidne DNA vaktsiin
Plasmiid-DNA vaktsiine kasutatakse loomade tervise huvides ning mitmed inimestele mõeldud plasmiid-DNA vaktsiinid on väljatöötamise ja kliinilise hindamise erinevates etappides. Pärast E. coli fermentatsiooni bakterid kogutakse ja lõigatakse, et vabastada plasmiidne DNA.
Rakujäänused eemaldatakse tavaliselt tsentrifuugimise või filtreerimise teel. Seda teemat on viimastes väljaannetes põhjalikult käsitletud. Selles väljaandes käsitletakse praeguseid ülesvoolu, allavoolu ja pDNA formuleerimise protsesse ja väljakutseid.
Autorid annavad ülevaate ka tüüpilise pDNA tootmisprotsessi igas etapis esinevatest lünkadest ja potentsiaalsetest tulevastest uuendustest ja/või praegustest tehnoloogilistest lünkadest, mis võivad viia protsessi edasise optimeerimiseni.
Plasmiid-DNA vaktsiinid valmistatakse kahes etapis. Esiteks eemaldatakse kultuurisöötmest bakterirakud ja teiseks rakujäägid pärast rakulüüsi eemaldamist. Sõltuvalt skaalast kogutakse rakud tsentrifuugimise või TFF-i mikrofiltrimise teel. Kettahunniku tsentrifuug väljutatakse vahelduvalt suurel kiirusel ja ülikeritud plasmiidide saagis on tühjendamise ajal tekkinud nihkekahjustuste tõttu halb. Kui tuleb kasutada tsentrifuugimist, sobib kõige paremini tahke kaussi tsentrifuug. Hästi võivad töötada avatud kanaliga lamedad TFF-seadmed, millel on 0,1 või 0,2 μm mikrofiltreerimismembraanid või õõneskiudseadmed.
Kuna õõneskiudseadmetel on suur tahke kandevõime, on need mõnikord eelistatud. Tavaliselt toimivad need protsessid 3-5-kordse kontsentratsiooniga, millele järgneb 3-5 transfiltratsiooni mahtu. Nihke vähendamiseks ja membraani polarisatsiooni paremaks juhtimiseks on tungivalt soovitatav kasutada läbitungimise kontrolli. Kuigi tsentrifuugid on suuremahuliste kommertsoperatsioonide puhul kuluefektiivsemad, kasutatakse väiksemahulistes protsessides kaasaskantavuse ja töölihtsuse tõttu tavaliselt filtreerimist.
Töötlemise hõlbustamiseks on kasutatud flokulande, kuid see võib põhjustada toote kadu. Mõned soovitavad kasutada ka inertseid kobediatomiidi osakesi, millele järgneb kottfiltreerimine.
Cell lysis produces viscous products, including large particles, cell fragments, soluble impurities, fine colloidal particles, and pDNA. Due to the complexity of the material, removing such fine solids is a difficult separation. Gradient density deep filter or open hole structure (>0,45 m) membraanfiltrid eemaldavad hästi rakujääke. Rakujäätmete tugeva ummistumise tõttu eelistatakse madala vooluhulga või madala rõhuga filtreerimist. Selle astme jaoks on kasutatud Tff-põhiseid mikrofiltreid ja tööstusliku mastaabiga kottfiltreid. Staatiline (segamisnõus) ja pidev (kasutades staatilist segistit) krakkimiseks on vaja erinevaid filtreid.
3.3 Juhtumiuuring: tsentrifuugimise, NFF- ja TFF-meetodite tõhususe võrdlus teetanuse toksiinide puhastamisel
Muniandi jt. võrreldi kolme erinevat meetodit teetanuse toksiinide ja toksoidide puhastamiseks fermentatsioonivedelikest, nimelt tsentrifuugimist, sügavfiltreerimist (NFF) ja TFF-i. Katsematerjal valmistati 400L fermenteris, kasutades modifitseeritud Milleri (MMM) söödet. Tsentrifuugimise uuringus eraldati rakud südamest kiirusel 4000 p / min 6 × 1 l mahutis 60 minutit. Toksoidi taastumise tuvastamiseks võeti supernatandi proovid. Sügavfiltreerimisel kasutatakse käärituspuljongi selgitamiseks 0,45 μm ja 0,22 μm sügavfiltreid, mis sisaldavad kobediatomiiti ja tselluloosi. Protsess viiakse läbi temperatuuril 35 kraadi ja 12psi.
Avatud lameekraaniga TFF-moodul on TFF-meetodil termiliselt ühendatud 0,22 μm PVDF-membraaniga. TFF-il põhinev selitamisprotsess viidi läbi ristvoolukiirusel 2000 l/h 23 kraadi juures ja selitatud filtraat kontsentreeriti ristvoolukiirusel 1000 l/h 25 kraadi juures, kasutades tavalist TFF kihilist 30 kD PES membraani. Selitatud lihavedelik (umbes 6L) kontsentreeritakse selles ultrafiltratsioonis 10 korda. Teetanuse toksoidi testid viidi läbi kontsentreeritud fiksaatorproovidega, et hinnata toote taastumist.
Sügavfiltreerimise tulemuseks oli toote taaskasutamise määr ligikaudu 89%, TFF-i ühikute tulemuseks oli toote taaskasutamise määr üle 97%. Mikrofiltreerimise ja ultrafiltreerimise protsessid annavad järjekindlalt suurema saagise kui NFF-protsess. Need tulemused põhinevad flokulatsioonitestidel (Lf).
04Polüsahhariidvaktsiinide selgitamine
4.1. Polüsahhariidvaktsiini selgitamise kaalumine
Nii sidumata/vabade polüsahhariidvaktsiinide kui ka seotud polüsahhariidvaktsiinide tootmisprotsess algab peremeesbakterite kultiveerimisega fermenteris. Fermentatsiooni lõpus võib baktereid töödelda puhastusvahenditega, nagu DOC (naatriumdeoksükolaat), Triton®X-100 või muude sobivate reaktiividega, et hävitada bakterid ja soodustada polüsahhariidide vabanemist. Aku suure mahutavuse tõttu ei ole kogumine otse NFF-i kaudu majanduslikult otstarbekas, kuna läbilaskevõime võib olla väga madal. Seetõttu on ideaalne valik rakukimpude eraldamiseks kasutada tsentrifuugi. Kasutada saab ka TFF-i mikrofiltreerimisvahemikku. Huvipakkuvat polüsahhariidi sisaldavat rakuvaba tsentrit/penetranti selgitatakse täiendavalt NFF-i süvafiltratsioonisüsteemiga, millele järgneb biofiltratsioon ja seejärel jätkatakse edasiseks puhastamiseks allavoolu töötlemist.
4.2 Polüsahhariidvaktsiini selgitamise strateegia
4.2.1 Esimene selgitusprotseduur
Tsentrifuugimine on üks levinumaid meetodeid rakkude eraldamiseks fermentatsioonivedelikest. Olenevalt skaalast saab valida pideva tsentrifuugimise või partiitsentrifuugimise. Oluline on märkida, et tsentrifuugimistingimuste ja nende toimimise nõuetekohane optimeerimine on eduka allavoolu puhastamise jaoks hädavajalik. Konkreetse TFF-membraani ja pooride suuruse valimisel on oluline meeles pidada polüsahhariidide molekulmassi, mis on sageli suured ja struktuurselt keerukad ning molekulmassiga vahemikus umbes 500kDa. rohkem kui 1000 kDa. Suure avatud pooride suuruse tõttu võib 0,22 μm, 0, 45 μm, 0, 65 μm MF membraanide kasutamine tagada PS molekulide eduka taastumise osmootses lahuses.
4.2.2 Teisene selgitusprotseduur
Sekundaarsesse selitamisetappi jõudva rakuvaba fermentatsioonilahuse selgus/hägusus sõltub spetsiifilistest bakteritest, lõhustamise tüübist, individuaalsest seerumi tüübist ja primaarses selgitamisetapis kasutatud tehnikast. Keskuse hägusus võib ulatuda umbes 50-150 NTU-ni. Positiivse laenguga fraktsioneeriva tihedusega süvafiltrit, mis on valmistatud täidetud tsellulooskiududega immutatud diatomiidist, saab kasutada selle selgitamiseks ja hägususe vähendamiseks kuni < 5NTU.
Selle süvafiltri läbilaskevõime võib ulatuda ligikaudu 150 l/m3 kuni 250 l/m3. Tavaliselt filtreeritakse selitatud tootelahus läbi järgneva 0,45 μm biotoega redutseerimisastme või 0,22 μm steriliseeritud astme membraani, et eemaldada kõik järelejäänud rakuosakesed, kolloidid ja potentsiaalsed mikroorganismid.
4.3 Juhtumiuuring: Streptococcus pneumoniae fermentatsioonipuljongi keskpunkti selgitamine pärast tsentrifuugimist
Rakud eraldati, lisades pideva tsentrifuugimise teel {{0}},1% (v/v) tüüpi 8 Streptococcus pneumoniae fermentatsioonipuljongi (20 l). Kollektsiooni keskosa filtreeritakse läbi kahe eraldi positiivselt laetud ja kobediatomiitmuldfiltri, mis sisaldavad tsellulooskiude. Seejärel filtreeriti individuaalne süvafiltri filtraat läbi bioloogiliselt koormatud redutseerimisastmega PVDF 0,45 μm membraani. Kõik filtreerimiskatsed viidi läbi konstantse voolu režiimis peristaltiliste pumpadega. Laetud süvafiltri ja Streptococcus pneumoniae serotüübi 8 fermentatsioonipuljongiga tehtud filtreerimistestid vähendasid hägusust ligikaudu 120 NTU-lt 3 NTU-le. Katsed viidi läbi voolukiirusel 140 150 l/m2/h ja lõpp-punkti rõhuerinevusel 20-25 psi, mahu läbilaskevõimega ligikaudu 180-200 l/m2.
Sarnased filtreerimiskatsed viidi läbi Streptococcus pneumoniae serotüübi 19A fermentatsioonipuljongiga. Tsentrifuugitud 19A vedelik selgitatakse läbi laetud süvafiltri, mis vähendab hägusust ligikaudu 40 NTU-lt 3 NTU-ni. Katsed viidi läbi konstantse voolukiirusega umbes 140-160 L/m2/h ja mahuline läbilaskevõime 200-230L/m2 saavutati lõpp-punkti rõhul umbes 15 psid. Filtreerimise hindamiskatsete käigus kogutud tooteproovide HLPC analüüs ei näidanud süvafiltreerimise ega 0,45 μm (või 0,22 μm) membraanide puhul olulist saagise kadu.
05 Järeldus
Selitamisprotsesside arendamiseks on vaja integreerida mitmed ühikprotsessid, nagu tsentrifuugimine, TFF-MF, sügavfiltreerimine ja aseptiline filtreerimine. Selgitamisprotsessi optimeerimine eeldab arusaamist, kuidas erinevad üksuste toimingud üksteist mõjutavad. Väljakutse on valida tehnoloogiad ja tööriistad (seadmed ja inventar), mis vastavad tänapäeva tõhusamate bioreaktorite toodetavate protsessivedelike üha keerukamatele nõuetele. Ülesvoolu tootlikkuse (viiruse tiiter, rakutihedus jne), rakujääkide ja rakulüüsiproduktide suurenemine muudab selgitamisprotsessi keerulisemaks ning segab eraldamis- ja filtreerimisseadmete valikut.
Protsessi skaala valimisel tuleks arvestada seadmete disaini, kasutusmugavust ja puhtust. See tagab tõhusa muundamise ja kasutaja ohutuse kasutuselt kõrvaldatud filtritega tegelemisel. Selgitamisprotsessi arendamiseks on oluline selgitamisetappide tugev integreerimine, et tagada ülesvoolu saagi töötlemise kulutõhusus. Valik filtreerimisseadmeid on hõlpsasti saadaval, et hõlbustada laboratoorseid katseid, katsetootmist ja täissuuruses töötlemist. Rakendades hästi läbimõeldud suurendamistööplaani, mis hindab mitut selgitamisvalikut, saab enesekindlalt valida ja mõõta selgitusfiltreid, et kaitsta alljärgnevaid üksuse toiminguid, vähendades samal ajal tegevuskulusid.
Vaktsiini selgitamine kujutab endast mitmeid väljakutseid. Tavaliselt tuleb filtreerimisprotsess kohandada tootmissüsteemile, inaktiveerimis- või lüüsiainele ja antigeeni esitusele, mitte tingimata vaktsiinidele. Traditsioonilised vaktsiiniprotsessid kasutavad vaktsiini esmaseks selgitamiseks tavaliselt tsentrifuugimist. Kaasaegsed vaktsiinid, millel on mitu tehnoloogiaplatvormi ja väiksemad töötlemismahud, muudavad vaktsiinid sobivamaks membraanipõhiste tehnoloogiate abil selgitamiseks. Äsja väljatöötatud vaktsiinid, mis kasutavad kaasaegseid rakuliine ja ekspressioonisüsteeme ning kasutavad täpsemaid rakukultuuri tingimusi, muudavad paljud vaktsiiniprotsessid filtreerimist soodustavamaks.
Vaktsiinitoodete antigeense komponendi või "sihtantigeeni" heterogeensus suurendab aga filtreerimise selgitamise keerukust. Antigeenid on erineva suuruse, pinnakeemia ja laengu poolest. Need omadused mõjutavad antigeenide saagist ja taastumist. Vaktsiinid kujutavad endast ainulaadseid probleeme selgitamisel, peamiselt nende makromolekulide suuruse tõttu. See koos selgitamisega seotud suutlikkuse probleemidega suurendab vajadust protsesside arendamise strateegiate juhendamise järele.
Vaktsiini tootmise kaubandusliku mastaabiga operatsiooni suurus ja ulatus mõjutavad oluliselt selgitamistehnoloogia valikut. Kuna see asub protsessist ülesvoolu, on nõuetekohane selgitamise optimeerimine üksuse allavoolu toimimise edukuse jaoks ülioluline, maksimeerides protsessi saagikust, taastumist ja töökindlust. Kuigi tsentrifuugimine on esmasel selgitamisel endiselt elujõuline tehniline võimalus, on vaktsiinitööstuses aktsepteeritud avatud kanaliga mikrofiltreerimisüksused (TFF) esmasel selitamiseks ja peened sügavfiltrid või membraanfiltrid sekundaarseks selgitamiseks. See muutus on tingitud vajadusest kiirema töötlemise, kiire protsesside arendamise, kaasaskantavate protsesside ja ühekordselt kasutatavate rakenduste järele. NFF pakub ökonoomset protsessi, mis sobib väikese kuni suuremahuliste ühekordsete valikute jaoks. Muutuvate regulatiivsete vajaduste tõttu soodustab autoklaavimiseks mõeldud gammakiirguse eelaseptiliste seadmete või moodulite kättesaadavus NFF-il või TFF-l põhinevate tehnoloogiate kiiremat kohandamist.
Paljud klassikalised vaktsiiniprotsessid hõlmavad selgitamisüksuse toimingute arengut, mis on suuresti tingitud regulatiivsetest piirangutest ja nendega seotud kõrgetest taasvalideerimise ja uuesti esitamise või kliiniliste uuringute kuludest. Filtreerimisel põhinevat selgitamisskeemi kasutavat platvormi protsessi on laialdaselt kasutatud mitmetes bioloogilistes ainetes ja väga edukalt. Selles dokumendis kirjeldatud näited ja juhtumid näitavad, et vaktsiinitootjatel on potentsiaal saavutada see stabiilsuse, majandusliku elujõulisuse ja ühekordselt kasutatava kasulikkuse tase, järgides mallipõhist lähenemisviisi.
Teised filtreerimise eelised tsentrifuugimise ees on nihketundlikud viirused või viirused, mis kipuvad kogunema õhuliidesesse. Kuna seadmete tootjad toovad turule uusi tooteid, on vaktsiinitootjatel ka edaspidi rohkem ettevalmistusi selgitamisprotsessi jaoks.
Esimese ettevõttena lokaliseerimisahelas on Guidling Technology kogunud piisavalt asjakohast kogemust vaktsiinide selgitamisel. Guidling Technology on arendus- ja tootmisettevõte, mis keskendub biofarmatseutilisele ja rakukultuurile, puhastamisele ja eraldamisele. Tooteid kasutatakse laialdaselt biomeditsiinis, diagnoosimisel, tööstusliku vedeliku filtreerimise, tuvastamise, selgitamise, puhastamise ja kontsentreerimise protsessis; Guidling on edukalt välja töötanud ultrafiltratsiooni tsentrifuugitoru, ultrafiltratsiooni/mikrofiltratsiooni membraanikasseti, viiruse eemaldamise filtri, tangentsiaalse voolu filtri seadme, sügava membraanivirna jne, mis vastavad täielikult biofarmatseutilise ja rakukultuuri rakendusstsenaariumidele.
Meie membraane ja membraanfiltreid kasutatakse laialdaselt eelfiltreerimise, mikrofiltreerimise, ultrafiltratsiooni ja nanofiltratsiooni kontsentreerimiseks, ekstraheerimiseks ja eraldamiseks. Meie lai valik tootesari, alates väikesest ühekordsest laboratoorsest filtreerimisest kuni tootmistüüpi filtreerimissüsteemideni, steriilsuse testimise, kääritamise, rakukultuuri ja muuga, suudab rahuldada testimise ja tootmise vajadused.