Uuring rekombinantse Escherichia coli suure tihedusega fermentatsioonilüsaadi selgitamise protsessi kohta
Selleks, et vähendada materjali vedeliku segamist kromatograafiasse ja parandada sihtvalgu taastumist, uuriti kahe rekombinantse Escherichia coli tüve suure tihedusega fermentatsioonilüsaadi selgistamisprotsessi. Valiti tüved BL21-HP1036 ja BL21-palA, mis ekspresseerivad Streptococcus suis ja Haemophilus parasuis'e võtmegeene. Valgusaagise hindamiseks hägususe ja elektroforeesi abil kasutati tangentsiaalset vooluprotsessi, kiiret tsentrifuugimisprotsessi ja membraanikasseti selgitamise protsessi.
Tulemused näitasid, et BL21-HP1036, BL21-palA suure tihedusega fermentatsioonilüsaat, mis ekspresseerib Streptococcus suis ja Haemophilus parasuis'e võtmegeene, selgitati membraanikassettfiltrimise ja tsentrifuugimisega ning valgu saagis oli üle 80%. mis võib tõhusalt vähendada kromatograafilisi häireid ja parandada taastumiskiirust.
Sissejuhatus
Praegu on seafarmides levinumad bakteriaalsete haiguste tekitajad Streptococcus suis (SS) ja Haemophilus parasuis (HPS), mis toovad seatööstusele suuri kahjusid. SS võib jagada kokku 35 serotüübiks 1-34 ja 1/2 ning HPS võib jagada 1-15 serotüübiks ning need kaks on sageli segunenud, põhjustades peamiselt sigade polüserosiiti, artriiti, meningiiti, endokardiiti , bakteriaalne septitseemia ja bronhiit.
Streptococcus suis ja Haemophilus parasuis'e serotüüpide suure arvu tõttu on erinevate serotüüpide vaheline ristkaitse nõrk ning antibiootikumiresistentsus suureneb antibiootikumidega ravimisel oluliselt, mis mõjutab ravitoimet.
Vaktsiinidest on saanud üks tõhusaid vahendeid SS-i ja HPS-i ennetamiseks. On inaktiveeritud vaktsiine, nõrgestatud vaktsiine, elusvaktsiine, subühikvaktsiine ja geneetiliselt muundatud vaktsiine, kuid peamiselt on müügil inaktiveeritud vaktsiinid ja nõrgestatud vaktsiinid ning nende immuunkaitse on hea, kuid ristkaitse pole ilmne. Subühikvaktsiin on uut tüüpi vaktsiin streptococcus suis'e vastu, mis on tugeva ristkaitse ja madala hinnaga uut tüüpi vaktsiin. Streptococcus suis'e ja Haemophilus parasuis'e alaühikuvaktsiinide uurimis- ja arendustöö pakub täiuslikku lahendust Hiina seatööstust vaevavate Streptococcus suis'e ja Haemophilus parasuis'e ennetamise ja tõrje probleemidele.
Streptococcus suis ja Haemophilus parasuis subühiku vaktsiinid on allutatud suure tihedusega fermentatsioonile rekombinantse Escherichia coli poolt. Lüsaadi selgitamisel on märklaudvalkude saagisele suur mõju, kuid asjakohaseid aruandeid on vähe. Kääritamise ja puhastamise protsessi selgitamise etapp on oluline töö. Käesolevas artiklis on rekombinantse E. coli BL21-HP1036, BL21-palA suure tihedusega fermentatsiooni eesmärk uurida, kuidas tõhusalt vähendada selgituslahuse hägusust, parandada valgu saagist. Streptococcus suis subühiku vaktsiini kääritamisprotsess tööstusliku purustamise ja selgitamise tehnoloogia saavutamiseks, et tagada teoreetiline alus ja tehniline tugi.
1. Materjalid ja meetodid
1.1 Materjalid
1.1.1 Tüved
Streptococcus suis ja Haemophilus parasuis tüved BL21-HP1036, BL21-pa-lA
1.1.2 Peamised söötmed ja reaktiivid
Pärmiekstrakt ja pringli; naatriumkloriid; kanamütsiin, IPTG; Formaldehüüd alates; SDS-PAGE geelikomplekt.
1.1.3 Peamised katseseadmed
Suure tihedusega fermentaator; Kiire tsentrifuug; Elektroforeesiaparaadid; Ultraviolett-geelpildisüsteem; Ultraheli purustaja; Väike kiire tsentrifuug; Ultraviolettkiirguse spektrofotomeeter; Konstantse temperatuuriga raputuslaud; Afiinsuskromatograafia seadmed.
1.2 Meetodid
1.2.1 Kõrge tihedusega fermentatsioonikultuur
Kvalifitseeritud rekombinantsed kolibakteri tüved BL21-HP1036 ja BL21-pa-lA inokuleeriti sünteetilisele söötmele 2% (V/V) ja kultiveeriti 37 kraadi juures 35-40 tundi.
1.2.2 Rekombinantse valgu indutseeritud ekspressioon
Kui fermentatsioonilahuse OD{{0}}±0,1, induktsioon algas, induktsioonitemperatuur oli 35 kraadi ±0,5 kraadi ja kultuur lõpetati pärast 10-tunnist induktsiooni.
1.2.3 Kõrgsurve homogeenne purustamine ja tsentrifuugimine
Inaktiveerimistesti läbinud bakterivedelik purustati kõrgsurvehomogenisaatoriga vastavalt rakkude lõhenemiseks rõhuga 100–150 MPa. Pärast purustamist hoiti purustatud vedelikku madalal temperatuuril.
Supernatant saadi tsentrifuugimisega suurel kiirusel, tsentrifugaalkiirus: 15000 pööret minutis, temperatuuri reguleerimine: 10 kraadi ~15 kraadi, süstimiskiirus vastavalt: 0,5-1 l/min, supernatant koguti ja supernatant täideti anumatega, mis eemaldasid endotoksiini.
1.2.4 Mikrofiltratsioonimembraanikasseti selgitamine
Membraan pesti ühes suunas 1 0L puhastatud veega ja viidi läbi tangentsiaalne voolufiltreerimine. 300 ml purustatud bakterisuspensiooni pärast tsentrifuugimist võeti torujuhtme tsentrifuugist ja selgitati 0,45 um mikrofiltratsioonimembraani kassetiga. Hägusust mõõdeti vastavalt proovide võtmisega ning võrreldi hägusust pärast tsentrifuugimist, selitatud vedeliku hägusust mikrofiltratsioonimembraanikassetis ja kontsentreeritud vedeliku hägusust mikrofiltratsioonimembraanikassetis. Valgu saagise hindamiseks määrati proovi valgusisaldus kromatograafia ja elektroforeesi abil.
2. samm: tulemused
2.1 BL21-HP1036 ja BL21-palA valgu selgitavad andmed ja testitulemused
Tulemused joonisel fig. 1 näitab, et BL21-HP1036 ja BL21-palA rekombinantse Escherichia coli purustamisvedeliku hägusus vähenes 4 500 NTU-lt ja 4 000 NTU-lt vastavalt 1970 NTU-le ja 520 NTU-le, pärast toru tsentrifuugimist. BL21-HP1036 ja BL21-palA rekombinantse Escherichia coli hägusust vähendati mikrofiltratsioonimembraanikasseti meetodil 25 NTU-ni ja 1,28 NTU-ni. On näha, et mikrofiltratsioonimembraanikasseti tangentsiaalse voolu filtreerimise ja optimeeritud avatud voolukanali kasutamisel on hea mõju endotoksiini, kromatograafilise vedeliku viskoossuse ja hägususe vähendamisele kui traditsiooniline tsentrifuugfiltreerimine ning see võib oluliselt vähendada purustatud rekombinantset E. coli heteroproteiini. ja nukleiinhapet.
2.2 BL21-HP1036 ja BL21-palA proovide valgu taastamine
Tabelis 1 on näidatud, et rekombinantne Escherichia coli BL21-HP1036 valk esineb nii mikrofiltrimisega selitatud lahuses kui ka mikrofiltratsioonimembraaniga kaetud kontsentreeritud supernatandis ning valgu kogusaagis pärast valgu eraldamist mikrofiltrimisega selitatud lahusest ja kontsentreeritud supernatandist. on umbes 88,5%. BL21-palA valk esines ka mikrofiltratsioonieksudaadi selitatud lahuses ja kontsentreeritud lahuse supernatant, mis oli kaetud mikrofiltratsioonimembraanikassetiga. BL21-PALa valgu kogusaagis oli 81,5%.
3. Järeldus
Selles artiklis läbisid Streptococcus suis'e ja Haemophilus parasuis'e võtmegeene BL{{0}}HP1036 ja BL21-palA ekspresseerivad tüved suure tihedusega fermentatsiooni ja läbisid 0,45. Materjali vedeliku hägusus oli um mikrofiltratsioonimembraanikasseti protsess vähendab oluliselt, mis näitab, et tangentsiaalse vooluga filtreerimistehnoloogia mikrofiltratsioonimembraanikassetiga oli parem kui kiire tsentrifuugi puhul ning see võib oluliselt vähendada purustatud rekombinantse Escherichia coli lisandvalku ja nukleiinhapet.
Pärast läbipaistva vedeliku kogumist ühte mikrofiltratsioonimembraanikassetti oli 62,9% Kuna 37,1% BL21-HP1036 sihtvalgust oli mikrofiltratsioonikontsentraat või oli mikrofiltratsioonimembraanikassetis ja muud kadud. , võeti selgitamiseks kasutusele kaheetapiline meetod. Esimeses etapis kasutati eksudaadi selgitamiseks ja kogumiseks 0,45 um mikrofiltratsioonimembraanikassetti; teises etapis koguti pärast katseklaasi tsentrifuugimist järelejäänud kontsentreeritud vedelik kokku ja kaheastmeline selitatud vedelik ühendati kromatograafiliseks prooviks. BL21-palA fermentatsioonivedeliku hägususe väärtus oluliselt ei suurenenud, valgu saagis võis ulatuda. rohkem kui 85,5% ja BL21-Pala fermentatsioonivedeliku valgusisaldus võib kaheetapilise töötlemise järel ulatuda 81,5%ni.
Mis puudutab mikrofiltratsioonimembraanikasseti valimist, siis Guidling Technology võib pakkuda teile kvaliteetseid lahendusi. Meie mikrofiltratsioonimembraanikasseti ja ultrafiltratsioonimembraanikasseti seeria tooted kasutavad kandjana spetsiaalselt biotehnoloogia jaoks loodud polüeetersulfooni. Meie polüeetersulfoonmembraani eelised on kõrge läbilaskevõime, madal valgu adsorptsioon, kõrge mehaaniline tugevus, löögikindlus ja nii edasi. Pakume teile spetsiaalseid membraaniklambreid, et mõõta reaalajas sisse- ja väljalaskeava rõhku, ning pakkuda tehnilisi külastusi vastavalt teie vajadustele, et kohandada teie spetsiaalset ultrafiltratsiooni/mikrofiltratsioonisüsteemi. Sellist väikest tangentsiaalset voolusüsteemi saab kasutada väikese, piloot- ja väikesemahulise tootmise jaoks ning see võib olla täielikult lineaarne võimendus, et vastata täielikult teie katsenõuetele ja tootmisnõuetele.
Guidlingi kohta
Guidling Technology on riiklik kõrgtehnoloogiline ettevõte, mis keskendub biofarmatseutikatele, rakukultuurile, biomeditsiini puhastamisele ja kontsentreerimisele, diagnostikale ja tööstuslikele vedelikele. Oleme edukalt välja töötanud tsentrifugaalfiltriseadmed, ultrafiltreerimis- ja mikrofiltreerimiskassetid, viirusfiltrid, TFF-süsteemid, sügavusfiltrid, õõneskiud jne. Mis vastavad täielikult biofarmatseutiliste preparaatide, rakukultuuri jne rakendusstsenaariumidele. Meie membraane ja membraanfiltreid kasutatakse laialdaselt eelfiltreerimise, mikrofiltreerimise, ultrafiltratsiooni ja nanofiltratsiooni kontsentreerimiseks, ekstraheerimiseks ja eraldamiseks. Meie paljud tootesarjad, alates väikesest ühekordselt kasutatavast laboratoorsest filtreerimisest kuni tootmise filtreerimissüsteemide, steriilsuse testimise, kääritamise, rakukultuuri ja muuni, vastavad testimise ja tootmise vajadustele. Guidling Technology ootab teiega koostööd!
