Allavoolu ultrafiltratsiooni/diafiltratsiooni kontsentreerimise protsess: kuidas tõhusalt vältida sihtvalgu läbitungimist ja kadu

Allavoolu ultrafiltratsiooni/diafiltratsiooni kontsentreerimise protsess: kuidas tõhusalt vältida sihtvalgu läbitungimist ja kadu

Rekombinantsete valkude, veretoodete ja muude bioloogiliste ainete järgnevates puhastusprotsessides kasutatakse ultrafiltratsiooni/diafiltratsiooni (UF/DF) lähteaine kontsentreerimiseks, puhvri vahetamiseks ning soolade ja väikeste molekulidega lisandite eemaldamiseks. Eraldamine toimub membraani sõelumise teel: suured molekulid, nagu monoklonaalsed antikehad (mAb) jäävad membraani, samas kui soolad, endotoksiinid, vabad peremeesraku valgud (HCP-d) ja muud väikesed -molekulilised lisandid läbivad membraani ja eemaldatakse permeaadis. Protsessi suurendamise ajal- võib kergesti tekkida sihtvalgu kadu läbi membraani, mis vähendab otseselt saagist ja suurendab partiikulusid. Mõnes töötingimustes võib permeaadis tuvastada valku, mis nõuab kiiret määramist, kas lekkinud komponendid on terved sihtmärk-mAb, lagunenud/fragmenteerunud agregaadid või peremeesraku valgud. See artikkel on jagatud kaheks suureks osaks: selles vaadeldakse traditsioonilisi protsesside{7}kontrolli lähenemisviise ja koos DOE-ga luuakse tugev protsessiaken, mida toetavad mitmed analüütilised meetodid, et määrata permeaadis tuvastatud valkude identiteet.

 

 

I. Sihtvalgu läbitungimise peamised põhjused UF/DF ajal läbi membraani

1. Liigne transmembraanne rõhk (TMP)
Kui rõhuerinevus membraanil on liiga suur, suureneb lahusti takistus, mis sunnib mõne monomeerse valgu permeaati. Suurendamise ajal- sisaldab toitepaak suuremat kogust materjali ja rõhukõikumised torustikus on tugevamad, mistõttu mööduv ülerõhk on tõenäolisem kui laborimastaabis.

2. Vale tangentsiaalne voolukiirus
Liiga väikese voolukiiruse korral moodustub membraani pinnale tihe kontsentratsiooni{0}}polarisatsioonikiht ja kohalik valgukontsentratsioon võib ületada membraani taluvusläve. Kui voolukiirus on liiga suur, võib nihkepinge põhjustada mAb struktuurset lõhustumist, tekitades väiksemaid valgufragmente, mis pääsevad vabalt läbi membraani pooride.

3. Liiga kõrge valgusisaldus lähteaines
Kui valgu kontsentratsioon söödas on liiga kõrge, koguneb valk membraani pinnale ja osa monomeersest valku võib kanduda permeaati. See on levinud probleem-suurtootmises.

4. pH või juhtivus väljaspool protsessi vahemikku
Muutused valgu laengu omadustes võivad vähendada selle hüdratatsiooniraadiust ja näivat osakeste suurust, mille tulemuseks on ebanormaalne membraani läbilaskvus.

5. Membraanikasseti vananemine, suur difusioonivoog või ebapiisav eelkonditsioneerimine{1}
Membraanikasseti füüsilised defektid võivad otseselt põhjustada valgu leket ja kujutada endast seadmete{0}}seotud ohtu. Korduv CIP tugevalt leeliseliste lahustega võib järk-järgult kahjustada polüeetersulfooni (PES) membraanimaterjali.

6. Liigne diafiltratsiooni maht
Pikaajalise diafiltratsiooni käigus võib pidev lahusti loputamine viia väikese koguse monomeerset valku järk-järgult minema.

 

II. Traditsioonilised praktilised meetmed sihtvalkude läbitungimise ja kadumise vältimiseks

(A) Protsessi parameetrite juhtimine

1. Transmembraanse rõhu (TMP) juhtimine
Määratlege rõhu ülemine hoiatuspiir ja looge blokeerimishäired, et vältida mööduvaid kõrgrõhu{0}}mõjusid membraanikihile. Pärast algparameetrite väikesemahulist määramist vähendage ohutut töörõhku-tootmise suurendamise ajal ja reserveerige sobiv protsessi tolerantsi vahemik.

2. Optimeerige ristvoolu kiirust
Looge stabiilne piirkiht ja vähendage kontsentratsiooni polarisatsiooni membraani pinnal läbi ristvoolu, minimeerides seeläbi valkude kogunemist membraani pinnale allikas.

3. Piirake lõppkontsentratsiooni pärast kontsentreerimist
Määratlege kontsentratsioonipiir valgu füüsikalis-keemiliste omaduste põhjal ja vältige liigset söödakontsentratsiooni. monoklonaalsete antikehade puhul ei ületa tavapärane lõppkontsentratsioon üldiselt 50 mg/ml; mõnede agregatsiooni{2}}aldis monoklonaalsete antikehade puhul tuleks kontsentratsiooni veelgi vähendada.

4. Kontrollige sööda pH-d ja juhtivust
Säilitage valgu stabiilne hüdraatunud osakeste suurus ja vältige molekulide kokkutõmbumist, mis on põhjustatud happe/aluse või ioonse{0}}tugevuse häiretest.

(B) Seadmed ja juhtimisseadised

1. Enne iga partii testige membraanikasseti terviklikkust
Enne iga partii tootmist tehke mull{0}}punkti test, et tuvastada purunenud membraanikiud. Kahjustatud membraanikassetid tuleb valgu pideva lekke vältimiseks kohe ära visata.

2. Standardiseerige CIP-puhastusprotseduur
Kontrollige NaOH kontsentratsiooni ja kokkupuuteaega. Pärast tugevalt aluselist puhastamist tasakaalustage membraanimaterjal täielikult, et vähendada membraani pooride deformatsiooni ohtu.

3. Kasutage etapiviisilist diafiltratsiooni
Kasutage soolade eemaldamiseks varases staadiumis suurt -mahupuhvri vahetust ja aeglustage diafiltratsiooni voolukiirust lõpp-punkti lähenedes, et vähendada valgu takistust ja kadu.

 

III. Protsessi kavandamise ruumi loomine DOE kaudu (QbD protsessi iseloomustus; kehtib IND esitamise korral)

1. Faktori sõelumine
Kuvage viis peamist UF/DF protsessiparameetrit (P): transmembraanne rõhk, etteande voolukiirus, valgu algkontsentratsioon, sööda pH ja töötemperatuur.
Vastuse muutujad: säilinud saagis, valgusisaldus permeaadis, membraani voog ja suure -molekulaarse-massiga agregaatide protsent.

Olulisuse analüüsi abil tehke kindlaks peamised tegurid, mis soodustavad valgu leket.

2. Vastuspinna modelleerimine
Valige vastusepinna koostamiseks ja parameetrite vastastikuste mõjude analüüsimiseks neli kõige olulisemat parameetrit. Paljudes töötingimustes võib üks parameeter jääda selle kvalifitseeritud vahemikku, samas kui kahe parameetri kombinatsioon võib põhjustada valgu läbitungimist. Selliseid interaktsiooniefekte ei saa tuvastada traditsiooniliste üks-tegur--ha-katsetega. Mudeli põhjal määratlege toimiv disainiruum. Kuni protsessi parameetrid jäävad sellesse vahemikku, saab tagada tõhusa valgupeetuse, samal ajal kui lisandid eemaldatakse diafiltratsiooniga.

3. Halvima-juhu väljakutse (vajalik protsessi iseloomustamiseks)
Tootmise varieeruvuse simuleerimiseks valige tööpiiride äärmuslikud protsessiparameetrid: maksimaalne TMP, minimaalne ristvoolukiirus ja ülemine{0}}valgukontsentratsioon. Veenduge, et isegi äärmuslikes töötingimustes ei toimuks ulatuslikku sihtvalgu kadu, mis vastab CMC ülevaatuse nõuetele.

 

IV. Mitu analüüsimeetodit permeaadis tuvastatud valkude tuvastamiseks ja sihtmärgiks oleva mAb, lagunemisfragmentide ja HCP eristamiseks

Analüütilise tõhususe, kulude ja regulatiivsete esitamise stsenaariumide põhjal võib meetodid jagada kahte kategooriasse: kiirsõeluuringud ja kinnitavad testid. Rutiinse protsessi jälgimise puhul tuleks prioriteediks seada kiirmeetodid; ebanormaalsete kõrvalekallete ilmnemisel tuleks kasutada täpseid tuvastamismeetodeid.

1. UV-spektrofotomeetria (kiire veebipõhine sõeluuring; eelistatud tavapäraseks{1}}poe põranda jälgimiseks)
Koguge permeaat ja mõõtke selle A280 neelduvus. See võimaldab ainult kindlaks teha, kas permeaadis on valku, ja see ei suuda eristada valguliike. Seda kasutatakse peamiselt protsesside rutiinseks jälgimiseks. Pidevalt kasvav A280 väärtus näitab süvenevat valgu leket ja nõuab diafiltratsiooni viivitamatut peatamist ja protsessi uurimist.

2. SDS-PAGE elektroforees (kõige sagedamini kasutatav kvalitatiivne identifitseerimismeetod)
Kasutage redutseerivat ja mitteredutseerivat
1) Kui riba asukoht on täielikult kooskõlas sihtmärk-mAb-ga, on puutumatu mAb läbinud membraani.
2) Kui ilmuvad väiksema -molekulaarse- massiga ribad, on valk läbinud hüdrolüütilise lõhustumise, tekitades mAb fragmente.
3) Kui ribad on hajutatud mitme mitmesuguse ribaga, on enamik neist pigem E. coli/CHO peremeesrakkudest pärinevad peremeesraku valgud (HCP-d), mitte sihtprodukt.

3. Suure-jõudlusega suurus-välistuskromatograafia (HPSEC)
Eraldage komponendid molekuli suuruse järgi ja võrrelge nende elueerimisaegu lähteaine kromatogrammi omadega:
- Peapiik, mille retentsiooniaeg on sama kui mAb, näitab puutumata sihtvalku.
- Varem elueeruv piik näitab suure-molekulaarse-massiga agregaate/fragmente.
- Hiljem elueeruv piik näitab madala-molekulaarse-lagunemise fragmente.
- Iseloomuliku põhipiigi puudumine viitab HCP lisandivalkudele.
See meetod võib anda kvantitatiivseid andmeid ja seda saab lisada protsessi kõrvalekallete uurimise aruannetesse; see on kliinilistes materjalides kõrgelt aktsepteeritud.

4. HCP host-rakuvalgu ELISA komplekti testimine
Kui permeaadis tuvastatakse valk, ELISA tulemus on kõrgem ja HPSEC ei näita iseloomulikku mAb piiki, võib põhimõtteliselt kindlaks teha, et lekkinud materjal on CHO peremeesraku valgud. See näitab ebatäielikku lisandite eemaldamist ülesvoolu puhastamise ajal; lisandid pestakse välja UF/DF etapis ja need ei kujuta endast toote kadu.

5. Afiinsuskromatograafia kontrollimine (valgu A kromatograafia)
Valk A seob spetsiifiliselt mAb-de Fc piirkonda. Laadige permeaadi proov kolonni: iseloomuliku elueerimispiigi ilmumine näitab intaktse sihtantikeha olemasolu; elueerimispiigi puudumine näitab, et permeaadis olevad valgud on kõik lisandivalgud.

6. Massispektromeetria (LC-MS) (sügav jälgitavus; kasutatakse protsessi peamiste kõrvalekallete uurimiseks)
LC-MS saab vahetult analüüsida aminohappejärjestust ja täpselt määrata valgu päritolu. Seda kasutatakse peamiselt keeruliste või ebatavaliste kõrvalekallete uurimiseks ja seda ei kasutata rutiinse-protsessi kontrolltestina.

V. Parandusmeetmed, mis vastavad erinevatele analüüsitulemustele

1. Permeaadis tuvastati intaktne märklaud-mAb
Vähendage transmembraanset rõhku ja lõppkontsentratsiooni pärast kontsentreerimist; kitsendada protsessi töövahemikku DOE tulemuste põhjal; ja kontrollige membraanikasseti terviklikkust.

2. Permeaadis tuvastatud antikehade lagunemise fragmendid
Uurige nihkepinget kogu protsessi vältel ja pH äärmusi; optimeerida ülesvoolu viiruse inaktiveerimise etappi, et vähendada valgu lõhustumist.

3. Permeaadis tuvastati ainult HCP lisandivalgud
UF/DF parameetrite reguleerimine pole vajalik. Jälgige probleemi eelmiste kromatograafia etappideni ja parandage lisandite eemaldamist afiinsus- ja ioonivahetuskromatograafia- ajal.

 

VI. Kokkuvõte

Valgu lekke vältimiseks UF/DF-i ajal tugineb traditsiooniline protsessijuhtimine ajaloolisele kogemusele, et määratleda üksikud punktiparameetrid, mis suudavad adekvaatselt käsitleda ainult stabiilset väikesemahulist tootmist. Stabiilse jõudluse tagamiseks protsessi järkjärgulise suurendamise -ülestamisel tuleks kasutada DOE-põhist protsessi iseloomustust, et luua piisava tolerantsiga protsesside kavandamise ruum. Intervall-põhine parameetrite juhtimine võib kompenseerida tootmise varieeruvust. Kui valk on permeaadis tuvastatud, võib lihtne UV-tuvastussüsteem anda esialgse hoiatuse, millele järgneb elektroforees, HPSEC ja ELISA jälgimiseks ja tuvastamiseks. See võimaldab täpselt eristada sihttoote ja peremeesraku{8}}lisandeid, võimaldades sihitud juurpõhjuste uurimist ja parandusmeetmeid. See on ka standardiseeritud uurimiskomponent, mis sisaldub praegu mAb-projektide CMC dokumentatsioonis.