Viirusetaoline osakeste vaktsiin ja selle allavoolu puhastusprotsess

Viiruselaadne osakeste (VLP) vaktsiin on vaktsiinitehnoloogia, mis põhineb viiruse struktuuril, kuid ei sisalda viiruse geneetilisi materjale. Nad stimuleerivad tugevat immuunvastust, jäljendades looduslike viiruste morfoloogiat ja pinna antigeene ning tagavad suurema ohutuse nende suutmatuse tõttu korrata. VLP vaktsiinid on parem alternatiiv traditsioonilistele vaktsiinidele (elusate ja inaktiveeritud). VLP vaktsiin ei saa kehas kopeerida, seega sobib see kõigile, sealhulgas rasedatele või kahjustatud immuunsussüsteemidega inimestele. Lisaks saab segmenteeritud genoomidega viiruste, näiteks gripiviiruste, Aafrika hobusehaiguste viiruste ja bluetongue viirustega kapsiidseid valke (sealhulgas muid struktuurivalgusid) kasutada ka VLP vaktsiinide väljatöötamiseks, muretsemata geneetiliste rekombinatsiooniprobleemide pärast, nagu nõrgestatud elusvaktsiinid. Teiseks on VLP -d võimelised jäljendama reaalsete viiruste struktuuri, erinevalt inaktiveeritud vaktsiinidest, mille struktuurilisi valke võib inaktiveerimise ajal muuta, põhjustades immunogeenset kahjustust.

 

Joonis fig. 1. VLP -de ja kimäärsete VLP -de moodustumismehhanism

 

VLP vaktsiini omadused

1. Looduslike viirustega sarnane struktuur: VLP-d koondatakse viiruse poolt või mitu struktuurset valku (näiteks kapsiidvalgud) ning nende suurus ja kuju on sarnased tegelike viirustega.

2. mitte nakkus: see ei sisalda viiruse genoomi, ei saa haigusi korrata ega põhjustada.

3. Kõrge immunogeensus: graanulit struktuuri saab immuunsussüsteemi abil tõhusalt ära tunda ja aktiveerida B -raku ja T -raku vastuseid. Võib indutseerida neutraliseerivaid antikehi ja raku immuunsust (nt HIV, HPV vaktsiinid).

4. kõrge ohutus: sobib madala immuunfunktsiooniga inimestele (näiteks B -hepatiit VLP vaktsiin).

 

Joonis fig. 2. saadaval VLP vaktsiinid

 

VLP vaktsiinide tootmissüsteem

VLP -sid saab toota mitmesuguste ekspressioonisüsteemide kaudu, ühised platvormid hõlmavad:

 

1. putukate raku-baculoviiruse süsteem:

Eelised: kõrge saagis, madalad kulud, sobivad valkude komplekteerimiseks.

Rakendus: HPV vaktsiin, Ebola vaktsiin.

 

2. imetajarakud (nt HEK293 rakud):

Eelised: translatsioonijärgsed modifikatsioonid on inimestele lähemal ja sobivad ümbritsetud VLP-de jaoks (näiteks gripivaktsiinid).

 

3. pärmisüsteemid (nt Pichia pastoris):

Eelised: kiiret, odavat, on kasutatud B -hepatiidi vaktsiinis.

 

4. taimesüsteemid (nt tubakakloroplastid):

Keskkonnasõbralik ja skaleeritav, väljatöötamisel (nt Noroviirus VLP vaktsiin).

 

VLP vaktsiini puhastusprotsess

VLP -de ekspressioonisüsteemide mitmekesisus põhjustab allavoolu puhastusprotsesside ebaühtlust.

 

 

Joonis fig. 3 Üldine allavoolu protsessi vooskeem

 

Saak ja selgitamine:

Igasuguses söötmes on rakukultuuri poolt progresseerumine suur hulk viiruseosakesi, aga ka palju rakukoe prahti, metaboolseid tooteid ja muid lisandeid, muutes söötme keskmise pilves või poolpilve, kui kultuurikeskkond otse kontsentreeritakse, ultrafiltratsioonimembraan blokeeritakse, et kontsentratsioon ei suuda täita. Seetõttu tuleb seda esiteks enne kontsentratsiooni selgitada, et eemaldada söötme suured osakesed, nii et see muutuks poolläbipaistvaks või läbipaistvaks lahenduseks ning söötme kontsentratsioon võib muuta kontsentratsiooniprotsessi normaalseks ja tagada ultrafiltratsioonimembraani tööstusaega. Selgitamine enne kultuurilahenduse koondumist on peamine tehniline seos kontsentratsiooni protsessis.

 

Tõhus selgitusprotsess nõuab tahkete osakeste eemaldamiseks suure võimekuse kombinatsiooni, suure saagise, hõlpsat ulatust ja kaitset allavoolu tööühikutele.

 

Meetod

Tsentrifuugimine: diferentsiaalne tsentrifuugimine eemaldab suured osakesed.

Sügav filtreerimine: kasutage supernatandi selgitamiseks mitmeastmelist filtrit (nt 1,2μm → 0. 45μm).

Tangentsiaalse voolu filtreerimine (TFF): sobib masstootmiseks, koondab proovid ja eemaldab väikesed lisandite osakesed.

 

Kui aga kultiveerimise skaala on liiga suur, võtab tsentrifuugimine kaua aega, on vaja palju sügavaid filtrimembraanisid, nii et tarbekaupade kulud suurenevad märkimisväärselt. Samal ajal vähendab rakukultuuri suur tihedus sügava filtri membraani koormust, mille tulemuseks on suurenenud kulud ja liigse toote lahjendamise.

 

TFF -membraanikomponenti on kahte tüüpi: lame kassett ja õõneskiud. Tangentsiaalse voolu filtreerimist (TFF) juhib transmembraanse rõhu erinevus. Membraani pooridest väiksemad ained ja lisandid läbivad membraani, samas kui lisandid, näiteks suuremate osakestega rakud, jäävad lõksus. Mikrofiltreerimiseks kasutatud membraani pooride suurus on {{0}}. 45/0,22 μm. Õõneskiud saab töödelda kõrge tahke sisaldusega vedelikku, näiteks suure tihedusega rakukultuuri sööde, see suudab kõrvaldada tsentrifuugimise ja filtreerimise etapid, vähem samme, lihtsat tööd, membraani saab korduvalt kasutada puhastamise, seadmete investeeringute ja töökulude vähendamise kaudu vastavalt modulaarse automatiseeritud tootmise nõuetele.

 

Ultrafiltratsiooni kontsentratsioon (TFF):

Sihtmärk: kromatograafilise ravi vähendamiseks parandage kromatograafilist efektiivsust ja kaitske kromatograafilist kolonni.

Üldiselt võib ultrafiltratsioon (TFF) kontsentreerida rohkem kui 100 korda VLP -le ja heteroproteiinide eemaldamise kiirus ulatub 99%-ni. Nende hulgas on õõnsa kiudmembraani filtreerimistehnoloogia eelised kerge ja madala nihkejõu eelised, mitte hõlpsasti ühendatav, paindlik töö, pikk eluiga, madala hinnaga ja kerge võimendus, seetõttu on soovitatav valida kontsentreeritud ja puhastatud VLP jaoks õõneskiud.

 

Kui kontsentratsiooni ja puhastamiseks kasutatakse ultrafiltreerimismeetodit, on väga oluline valida õige membraani pooride suurus, mis määrab kontsentratsiooni tõhususe ja kvaliteedi otse. Ühest küljest on vaja valida membraani ava, et saagikuse tagamiseks sihtmolekulid tõhusalt lõksu jääda, ja teisest küljest tuleks täielikult arvestada heteroproteiinide eemaldamise ja töötlemiskiirusega. Seetõttu on parim põhimõte valida suurima pooride suurusega membraan, mis suudab sihtmolekuli lõksu püüda, ja proovige valida filtrimembraani ühtlase pooride suuruse jaotusega.

 

Esmane puhastamine:

1. sademete meetod

Polüetüleenglükooli (PEG) sademed: VLP -de selektiivne sademed nõuab saagikuse ja puhtuse tasakaalustamiseks optimeeritud PEG kontsentratsiooni ja soola kontsentratsiooni.

 

2. kromatograafia

Afiinsuskromatograafia:

Hepariini afiinsus: Pinna negatiivse laengu VLPS -i omaduste kasutamine (nt HPV VLP).

Antikehade ühendamise kromatograafia: kõrge spetsiifilisus, kuid kallis.

Ioonvahetuse kromatograafia (IEX): valige anioonvahetus (nt Q veerg) või katioonivahetus (nt SP veerg) sõltuvalt VLP pinnalaengu omadustest ning optimeerige osakeste agregatsiooni vältimiseks pH ja soola gradient.

Hüdrofoobne interaktsiooni kromatograafia (HIC): põhineb VLP-de pinnahüdrofoobsusel, mis sobib mõnele kapseldamata VLP-dele.

 

Peen puhastamine:

Molekulaarne välistamiskromatograafia (SEC, geeli filtreerimine):

Peremeesvalkude, nukleiinhapete või agregaatide eemaldamine koos puhvri asendamisega. Kõrge eraldusvõime, kuid madal voog, mida sageli kasutatakse lõpliku täpsustamise etapina.

 

Mitme režiimi kromatograafia:

Näiteks võivad CAPTO tuumaseeria vaigud koos ioonvahetuse ja molekulaarse sõela efektiga eemaldada ühe sammuga mitmesugused lisandid.

 

Viiruse inaktiveerimine/nukleiinhapete eemaldamine (vajadusel):

Nukleaseravi: nagu bensonaas lagundab peremeesorganismi DNA/RNA.

UF/DF: TFF -süsteemi koordineerimine väikeste nukleiinhapete ja ensüümide fragmentide eemaldamiseks.

 

Kontsentratsioon ja ettevalmistamine:

Tangentsiaalse voo filtreerimine (TFF):

Keskenduge tiitrite sihtimisele, nihutades samal ajal puhvreid (näiteks PBS -i või koostise puhvreid).

 

Steriilne filtreerimine:

0. 22 μm membraani filtreerimine tagab steriilsuse.

 

Tüüpiline juhtum

Järgmised on tüüpiliste VLP -vaktsiinide puhastusprotsessid.

 

 

Guidingu kohta

Guiding Technology on tootmisele orienteeritud ja kõrgtehnoloogia ettevõte, mis keskendub biofarmatseutiliste toodete järgnevale selgitamisele, eraldamisele ja puhastamisele. Tooteid kasutatakse laialdaselt mAb, vaktsiini, diagnoosimise, veretoodete, seerumi, endotoksiini ja muude bioloogiliste toodete filtreerimisprotsessis; Guiding Technology on "kassettide filter ja tangentsiaalse voo filtreerimisseade", "õõnes kiudmembraan", "viirusefilter", "sügav membraan", "steriliseerimisfilter", "tsentrifugaalfiltri seadmed" ja muud tooted, ning sellel on suur hulk tootesarke, alates väikesest laboratoorsest filtreerimisest filtreerimise süsteemiks, mis vastavad vajadustele ja toodatele. Guiding Technology ootab teiega koostööd!