Kokkuvõte:

Selles artiklis käsitletakse kahte peamist tegurit, mida tuleb arvestada valkude puhastamise strateegiates: rakenduse järgneva nõuded ja valkude endi bioloogilised omadused. Artiklis rõhutatakse, et kvaliteetne valkude puhastamine on eksperimentaalsete andmete usaldusväärsuse ja korratavuse alus, eriti rekombinantsete valkude tootmiseks. Erinevatel rakendusstsenaariumidel on spetsiifilised nõuded valkude puhtuse, aktiivsuse või endotoksiini sisalduse osas ning valkude omadused võivad puhastusstrateegiaid märkimisväärselt mõjutada. Spetsiifiliste juhtumite kohaselt illustreerib artikkel, et ainulaadsed valgud peaksid kasutama kohandatud puhastusskeeme. Lõpuks pakuti välja süstemaatiline valkude tootmisprotsess (joonis 1), rõhutades täielikku protsessi kvaliteedikontrolli alates ekspressioonisüsteemide valimisest, ehituse projekteerimisest kuni puhastamise optimeerimiseni ja soovitada valkude homogeensuse ja funktsionaalsuse hindamist biofüüsikaliste tehnikate kaudu (näiteks SEC-MALLID, DSF jne). Selle artikli eesmärk on anda teadlastele praktilisi juhiseid, aidates neil sõnastada tõhusad ja korratavad puhastusstrateegiad, mis põhinevad sihtvalkude omadustel ja rakendusnõuetel, suurendades sellega teadusuuringute kvaliteeti ja tõhusust.

 

Joonis 1. Valgu tootmisprotsessi skemaatiline diagramm

 

Kõrgnäärmega valkude tootmine - näited probleemide tuvastamise, leevendusstrateegia kavandamise ja vastava väljundi kohta

 

1. nukleiinhappe seondumine valguga:

Nukleiinhapete siduvate valkude puhastamisel on nukleiinhappe saastumise eemaldamiseks vaja mitut etappi. Lüüsi ajal tuleb lisada nukleaase (näiteks SM nukleaas (bensonaas®) või DNaas või RNaas), kuid seotud nukleiinhappeid ei saa täielikult eemaldada. Asendage nukleiinhapete eemaldamise etapid, näiteks PEI või streptomütsiinsulfaadi sademed, hepariini puhastamine või ioonvahetuskromatograafia. Nukleiinhapete olemasolu jälgiti A26 0 nm\/a28 0 nm suhtega kogu puhastusprotsessi vältel. Kui suhe oli madalam kui 0,6, näitas see, et valgu puhtus oli suhteliselt kõrge ja nukleiinhappe saastumine minimaalne. Tugevalt seotud nukleiinhapetega valkude puhul saab neid ajutiselt denatureerida (näiteks karbamiidiga töödeldud) ja seejärel renereerida. Põhipunktid: kasutage kvaliteetseid reagente, värskeid puhvreid ja puhtaid sambaid (puhas enne kasutamist 0,5M NaOH-ga).

 

2. hiire ferritiini raske kett:

Puhastatud hiire ferritiini raske ahela (MFTH1) valgu tootmise eesmärk on kõrge eraldusvõimega üheosaline krüoelektronmikroskoopia (Cryo-EM). Escherichia coli ekspressioonivektor kodeeriti märgistamata MFTH1 ultraheliliselt häiritud ilma nukleaasi lisamata. Pärast kuumutamist temperatuuril 7 0 läbis see ammooniumsulfaadi sademeid, dialüüsi ja suuruse välistamiskromatograafia etappe. Saadud proov näitas krüoelektronmikroskoopia kujutistes suure hulga saasteainete olemasolu (joonis 2A), mis polnud selle kasutamisel täiesti sobimatu. Optimeerige samme. Lisage SM nukleaas raku lüüsiprotsessis ja dialüüsiprotsessis pärast ammooniumsulfaadi sadestamist ja lisage seejärel anioonvahetuse kromatograafia etapp, et vähendada A26 0 nm\/A280NM suhet 1,4 kuni 0,8. Pärast suuruse välistamiskromatograafiat oli MFTH1 proovi A260NM\/A280NM suhe 0,56. SDS-PAGE ja krüoelektronmikroskoopia kujutised (joonis 2B) näitasid, et valk oli väga puhas, mis näitab, et saasteained olid tõhusalt eemaldatud.

Joonis 2 hiire ferritiini raske ahel

 

 

 

3. kimäärne valk inimese DSRBEC (DSRBD-EGF-Chimera):

DSRBEC moodustatakse inimese proteiinkinaasi R ja inimese epidermise kasvufaktori (HEGF) kaheahelalise RNA sidumisdomeeni (DSRBD) sulandumisega. Kui DSRBD ekspresseeritakse Escherichia colis, näitab see äärmiselt kõrget dsRNA sidumisvõimet. Pärast raku lüüsi takistab saastev RNA rekombinantsete valkude seondumist fikseeritud metalliioonide afiinsuskromatograafia (IMAC) kolonniga. Tavapärased meetodid nagu PEI või streptomütsiinsulfaadi sademed, RNaasi töötlemine või kõrge soolpuhverlahused ei saa RNA-d eemaldada. Rakkude lüüs viidi läbi 4M karbamiidi sisaldava puhvri abil. Supernatant laaditi IMAC -kolonni ja 4m kuni 0 m Karbamiidi kasutati aeglaselt üleöö (kolonni renatulatsioon). Renatureerimispuhver lisati imidasooliga ja elueeriti iMaci kolonnist. Lõplik viimistlus viidi läbi SuperDex 75 geeli filtreerimise kaudu, et saada funktsionaalselt aktiivne DSRBEC.

 

4. valguse katioonide või muude kofaktoritega seotud valgud:

Valkude jaoks, mis interakteeruvad selliste diivalentsete katioonidega nagu Zn 2+, fe 2+, cu 2+ või muude kofaktoritega, on ülioluline lisada ekspressiooni ajal spetsiifilisi diivalentseid katteid (või muid kofaktoreid). Puhastusprotsessi käigus on vaja ka väikest kogust samade kahevalentseid katioone (või muid kofaktoreid). Kõigi kelaativate ainete (näiteks EDTA, EGTA) ja kelaativate ainete (näiteks DTT või DTE) kasutamist tuleb vältida. Divalentsete katioonidega seotud valkudega tegelemisel tuleb proteaasi inhibiitorite segu ilma kelaativate aineteta kasutada, et kinnitada divalemaalsete katioonide (või muude kofaktorite) tegelikku olemasolu puhastatud valgus spektroskoopiliste meetodite abil (näiteks aatom neeldumisspektrofotomeetria).

 

5. rekombinantne ferridoksiin (RFD), mis sisaldab üksikut [2FE ± 2S] klastrit termofiilsetest tsüanobakterite mastigocladus laminosus

Ferridoksiin on lahustuv raud-väävli valk, mis osaleb elektronide ülekandereaktsioonides. Taime tüüpi ferredoksiin kannab fotosüsteemi I elektronide aktseptorina üksikut [2FE ± 2S] klastrit. Escherichia coli BL21 (DE3) tüvi ekspresseeris rekombinantset RFD-valku TB-söötmes, mis sisaldas 10mm FECL3 ja antibiootikume. IMAC -i püüdmiskolonni elueerimine viidi läbi puhver, mis sisaldas 10 mm histidiini, et vältida imidasooli ja vältida klastri [2FE ± 2S] hävitamist. Anioonvahetuse ja suuruse välistamiskromatograafiat kasutati kristalliseerumise sõeluuringuks kuni 12 mg\/ml -ni. Võrreldes ferredoksiini rekombinantse tootmisega, saavutas loodusliku ferredoksiin puhastatud siniroheliste vetikate mastigocladus laminosus kristalliseerumise ajal kõrgema eraldusvõime.

 

6. Antigeenidena kasutatud valgud

Valke kasutatakse sageli antigeenidena sihtspetsiifiliste ligandide taastamiseks. Esimene asi, mida tuleb arvestada, on see, kas valku kasutatakse in vivo immuunsuse jaoks tavapärase monoklonaalse või polüklonaalse IgG saamiseks, või programmide jaoks, mis hõlmavad kaameli IgG või in vitro valimisprotsesse.

 

6.1 Rutiinse antikehade tootmiseks kasutatud antigeenid

Kui antigeene kasutatakse monoklonaalsete IgG antikehade tootmiseks, pole antigeeni õige voltimine tavaliselt vajalik, kuna enamik monoklonaalseid antikehasid tunnistab lineaarseid epitoope, mida antigeeni struktuur suuresti ei mõjuta, ja isegi denatureeritud antigeenid (näiteks kaldumiskeha valgud) jäävad efektiivseks. Puhtust tuleb siiski rangelt kontrollida, et vältida tugevaid immunogeenseid saasteaineid, mis segavad immuunvastust ja põhjustades sihtmärgi antikehade domineerimist.

 

6.2 Konjugaadi raamatukogu sõelumine

Erilist tähelepanu tuleks pöörata antigeeni loomuliku konformatsiooni säilitamisele kaameli immuniseerimisega saadud nanobodikogude töötlemisel. Erinevalt tavalistest antikehadest tunnevad kaameli antikehad (eriti nanobodiad) struktuurseid epitoope, mis on seotud nende ainulaadse kumer täiendava saidi struktuuriga. Sarnaselt peab antigeen suuri sünteetilisi või looduslikke antikehade raamatukogusid in vitro säilitama struktuuri, mis on täiesti kooskõlas sihtrakendusega. Kuna sõelumisprotsess ise ei ole kallutatud, kui antigeenil on valesti voldimine, agregeerimine või konformatsiooniline heterogeensus, võib skriinida suure hulga konjugaate, mis on suunatud mitteloomulistele epitoopidele.

 

 

 

7. Valgud, mis sisaldavad molekulidevahelisi või molekulaarseid disulfiidsidemeid või vaba tsüsteiini

Dusulfiidsidemed on valkude loodusliku struktuuri stabiliseerimiseks üliolulised. Puhastusprotsessi ajal, mis sisaldavad molekulidevahelisi või molekulaarseid disulfiidisidemeid, on vaja puhastamisprotsessil vältida redutseerivate ainete lisamist, et vältida valkude konformatsioonilisi muutusi, muutes seeläbi nende funktsioone. Vaba tsüsteiini sisaldavate valkude puhul on redutseerivad ained puhastusprotsessi kõigis etappides hädavajalikud, eriti ladustamise ajal, et vältida kunstlike disulfiidsidemete moodustumist. Kõige sagedamini kasutatavad redutsendid on ditiothreitool (DTT), -merkaptoetanool (-me) ja Tris (2- karboksüetüül) fosfiinvesinikkloriid (TCEP). IMAC -vaikude puhul, mis ei ühildu DTT või TCEP -ga, on soovitatav kasutada järgmistes etappides -Me ja asendada need teiste redutseerivate ainetega.

 

8. rekombinantne antikehade fragment

Ehkki rekombinantsete antikehade fragmentide (näiteks nanobodies) struktuur on lihtsam kui IgG oma, sõltub nende funktsioon disulfiidsidemete õigest moodustumisest. Bakteriaalsetes ekspressioonisüsteemides võivad isegi optimeerimisstrateegiate kasutuselevõtu korral siiski tekkida valesti volditud või osaliselt volditud tooted, mis eksisteerivad nii lahustuvas osas kui ka kaasamise korpuses. Veel varjatud on see, et isegi õigesti volditud antikehade fragmendid võivad pinna hüdrofoobsete naastude kaudu moodustada lahustuvaid agregaate (kolloidne agregatsioon). Selliseid agregaate on rutiinsetes funktsionaalsetes testides (näiteks ELISA) raske tuvastada, kuna multivalentne seondumine võib varjata monomeeri afiinsuse langust, kuid nende olemasolu võib tõsiselt mõjutada rakendusi, mis tuginevad väikese molekuli suurusele (näiteks ülikerge eraldusvõime mikroskoopia). Seetõttu ei ole valimi kvaliteedi hindamiseks piisav ainult SDS-PAGE-le tuginemine. Monomeeride (peamiste piikide) eristamiseks agregaatidest (välistamismahu tipud) tuleb kasutada biofüüsikalisi meetodeid, näiteks geeli filtreerimine (joonis 3). Peamised kontrollpunktid hõlmavad järgmist: redoksikeskkonna optimeerimine ekspressiooni ajal, et soodustada disulfiidsideme moodustumist ja säilitamistingimuste optimeerimist pärast puhastamist, et vältida agregatsiooni. Need meetmed on üliolulised antikehade fragmentide monodipersiooni ja funktsiooni tagamiseks.

Joonis 3. Nanoboodide lahustuvate agregaatide geeli filtreerimine

 

9

Disulfiidsidemest sõltuvate valkude (näiteks lümfotsüütide retseptori LLT1) rekombinantne ekspressioon seisab sageli kokku voltimisraskustega. Metsikut tüüpi LLT1 geeli filtreerimine näitas agregatsiooni piike ja dimeeri piike (joonis 4A), kuid massispektromeetria näitas dimeeris paarimata tsüsteiini põhjustatud valesti voldimist (joonis 4B). Sel eesmärgil kavandati kaks mutanti: üks eemaldas probleemi tsüsteiini, mille tulemuseks oli saagikuse järsk langus (joonis 4A); Pärast neotsüsteiini kasutuselevõttu vastava disulfiidsideme rekonstrueerimiseks polnud mutandil mitte ainult kõrge saagikus ja hea stabiilsus, vaid ka kristalliseerumine (joonis 4C) ning 3D -struktuur kinnitas, et mutant moodustas õige disulfiidsideme ja säilitas loomuliku voltimise. See juhtum näitab, et konformaalsete disulfiidisidemetega ratsionaalselt kavandades koos geeli filtreerimise ja massispektromeetria analüüsiga, saab rekombinantsete valkude kokkuklapitava probleemi tõhusalt lahendada ning stabiilsete struktuuridega funktsionaalsed valgud ja suure saagikuse saamine.

Joonis 4. Dusulfiidsideme rekonstrueerimine parandab lahustuva LLT1 voltimist ja tootlust

 

 

 

10. Kergesti agregeeritavad valgud

Rekombinantsete valkude puhastamine seisab sageli silmitsi agregatsiooniprobleemiga ja selle moodustumine järgib "tuuma moodustumise kasvu" mehhanismi-kõigepealt moodustub väike kogus lahustuvaid agregaate ja käivitab seejärel suuremahulise lahustumatu agregatsiooni. Selle väljakutsega tegelemiseks tuleb vastu võtta mitmetasandilised strateegiad: ekspressioonietapis saab seda saavutada tüve optimeerimisega, kultuuri temperatuuri vähendamisel, modifitseeritud söötme kasutamisel või erinevate lahustuvate sulatunnete valkude abil ja ekspressioonisüsteemide asendamist (putukaid\/imetajate rakke) jne. Kiire töö vältimiseks on vajalik, kui 4-astmeline C-keskkond on vajalik, kui 4-astmeline keskkond on kiirelt, kui 4-astmeline keskkond) on vajalik, kui see on otsese valguse jaoks. tuleks võtta vastu agregaatide viivitamiseks tuumade eemaldamiseks. Üldiselt tuleks puhverlahenduste skriinimisel arvestada selliseid tegureid nagu komponentide kompositsioon, pH väärtus, dissotsieeruv aine või lahusti (joonis 5). Ortogonaalse tuvastamise (nt SEC, CD, LS, DSF ja temperatuuri nihe fluorestsentssoojus jne põhjal) peene optimeerimise kaudu määrati valgu kvaliteet ja kõige sobivam puhverlahus.

Joonis 5. Valgu agregatsiooni leevendamise strateegiad

 

11. inimese CLK1 kinaasi kristalliseerumine (kuidas saada reprodutseeritavaid partiid

Homogeense mittefosforüülimata CLK1 kinaasi saamiseks kristalliseerumise uuringute jaoks võeti vastu mitme strateegia koostööskeem. Esiteks ekspresseeriti see koos λ -fosfataasiga Escherichia colis, et kõrvaldada autofosforüülimise heterogeensus. Ehkki saagis vähenes, tagati täielik defosforüülimine. Pärast IMAC -i jäädvustamist täiendati eluent stabilisaatoritega (50 mm arginiin, 50 mm glutamiinhape ja 10 mm DTT), et vältida agregatsiooni, kontsentreeritud, ja tema silt eemaldati Tev seedimisega. Seejärel eraldati õige oligomeer SEC -ga (sisaldas 5% glütserooli ja -ME). Lõplik ülioluline anioonvahetuse etapp eristab kristalset (mittefosforüülitud) ja mittekristallilisi (osaliselt fosforüülitud) CLK1 rühmi. Eriti väärib märkimist, et raku lüüsi režiim mõjutab märkimisväärselt valkude stabiilsust-kõrgsurve- ja kõrgtemperatuuri meetod viib CLK1 pöördumatu agregatsiooni, tuues välja kerge ravi olulisuse kinaasi ettevalmistamisel.

 

 

 

12. toota galektiin -1 stabiilse ligandi sidumisvõimega

Funktsionaalse galektiini -1 ettevalmistamiseks ligandi sidumise uuringute jaoks olid nelja konstruktsiooni (märgistamata ja oma märgistamata metsiktüüpi galektiin -1, märgistamata ja oma märgistamata tsüsteiinivaba mutaktiini {-1 ekspressioonistrateegiad. Peamised leiud näitavad, et laktoosi afiinsuskromatograafia puhastamine võib tõhusalt sõeluda õigesti volditud valke, kuid see tuleb kombineerida põhjaliku dialüüsiga (HEPES -puhver), et laktoos sidumiskohast täielikult eemaldada ja CRD aktiivsust taastada. Metsikut tüüpi galektiin -1 on altid oksüdatsioonile ja inaktiveerimisele ning selle stabiilsus on piiratud isegi redutseerivate ainete juuresolekul (joonis 6). Kuid tsüsteiinivaba mutant suurendab märkimisväärselt pikaajalist stabiilsust, säilitades samal ajal võrreldava aglutinatsiooni aktiivsuse ja termilise stabiilsuse (kontrollitud NanoDSF, ITC jne abil), kõrvaldades disulfiidsideme sõltuvuse.

Joonis 6. Rekombinantse galektiini -1 hüdrodünaamiline iseloomustus näitab

 

13. Endotoksiini eemaldamine

Endotoksiinide eemaldamise meetod põhineb afiinsuskromatograafial, sealhulgas positiivselt laetud kromatograafia (anioonvahetus), polükatsiooniliste ligandide (näiteks polü-l-lüsiini (PLL), immobiliseeritud polüamiini (polümüksiin B) kasutamisel, kasutamine ja surraktiivne triton X {2} {2} lisamine. Puhastusprotsessi ajal pöörake tähelepanu puhverlahuse ettevalmistamisele LPS-vaba veega ja kasutage uusi veerge või veerge, mida on kasutatud ainult muudes LPS-vabades puhastustes. Endotoksiini saastumiseks saab kromatograafilist pumba\/vedeliku süsteemi inkubeerida üleöö 0. 5M NaOH või 4 tundi 1. 0 m NaOH. Lõplikku LPS -i kogust proovis hinnati Limulus amebotsüütide lüsaadi reagendi (LAL) abil ja kontrolliti, kas see oli allapoole konkreetse rakenduse jaoks vajalikku piiri.

 

14. valgukompleks

Valgukomplekside ekspressioon ja puhastamine tuleb optimeerida vastavalt konkreetsetele tingimustele. Väljakutsete hulka kuulub alaühikute ebastabiilsus või valesti. Iga alaühikut saab väljendada iseseisvalt ja in vitro kokku panna või ekspresseerida, et moodustada funktsionaalseid valgukomplekse. Ehituse konstruktsioon tuleks hoolikalt kasutusele võtta puhastus- või avastamismärgistega, et vältida kokkupanemist, eriti kui keeruline teave on piiratud ja vaja on mitut optimeerimist. Puhastusprotsessi ajal tuleb hinnata kompleksi terviklikkust ja stabiilsust. Meetodid hõlmavad SDS-PAGE (subühiku tuvastamine), SEC (homogeensus), SEC-Mals (molaarmassi analüüs), massifotomeetria või loodusliku massispektromeetria (massi kontrollimine). Tuleb märkida, et kompleks võib dissotsieeruda madalates kontsentratsioonides. Sel ajal tuleb optimeerida kromatograafiline meetod või puhver (näiteks termilise triivi või DSF -i sõeluuringu tingimuste kaudu). Lisaks võib puhastamise etappide vähendamine takistada nõrkade interaktsiooni alaühikute kaotamist ja tasakaalustada puhastamise efektiivsust ja kompleksi terviklikkust.

 

 

 

15. Antigeeni-antikehade komplekside puhastamine

Antikeha-antigeeni kompleksid on tüüpilised näited valgukompleksidest. Nende kaaskristallimine võib paljastada sidumisharjumusi ja suunata antikehade inseneri optimeerimist. Traditsioonilised meetodid nõuavad antigeenide ja antikehade eraldi puhastamist ning seejärel segamist. Hiljutised uuringud on siiski näidanud, et koos ekspressiooni- ja kaaspuhumise strateegiad on tõhusamad. Kompleksi saamiseks on vaja ainult ühte puhastamist ja samal ajal saab ebastabiilseid antigeene stabiliseerida antikehade kaudu ja saavutada isegi sildivaba ekspressioon. Selles konkreetses olukorras on SDS-PAGE ja geeli filtreerimine (SEC) tavaliselt piisav kompleksi puhtuse ja kvaliteedi hindamiseks.

 

Kokkuvõte

Valkude puhastamine on teadusuuringute põhitehnoloogia. Akadeemilise ulatusega valkude tootmine järgib tavaliselt standardstrateegiaid ja võib toota milligrammi tasemel kõrgpuhustuvaid, lahustuvaid valke, mida kasutatakse laialdaselt struktuurbioloogias, biokeemias ja funktsionaalses uurimistöös. Kuid allavoolu rakenduste erinõuded (näiteks vajadus endotoksiini järele loomkatsetes ja nukleiinhappe uurimisel nukleaasi saastumine) või valkude loomupärased omadused (näiteks lihtne agregatsioon, mis sisaldab disulfiidsidemeid või kõrge nukleiinhappe afiinsust), vajavad sageli kohandatud lahendusi. See ülevaade pakub vastuseks nendele erioludele välja rafineeritud strateegiad, alates ekspressioonisüsteemide valimisest, konstruktsioonide (siltide ja domeeni piiride optimeerimisest) kavandamisest kuni puhastusprotsessini ning tutvustab kvaliteedikontrolli (näiteks SEC, SDS-PAGE, Aktiivsuse tuvastamine jne) võtmetappides. Mõned rakendused nõuavad ka täiendavat analüüsi (näiteks endotoksiinide tuvastamine ja nukleiinhappe jääkide määramine), mis sarnaneb biofarmatseutilises tööstuses "kvaliteeditagamise" (QA) kontseptsiooniga, st defektide vältimiseks süstemaatiliste protsesside kaudu. Kvaliteedikontrolli suuniste koostamisega ja teadusuuringutes kasutatavate valgureaktiivide spetsiifilisi standardeid selgitades on eesmärk kehtestada rangemad valgu puhastamise normid akadeemiliste laboratooriumide jaoks, suurendada eksperimentaalsete andmete usaldusväärsust ja korratavust ning ühendada lõhe põhitöö ja tööstusstandardite vahel.

 

Doi: 10.1186\/s 12934-022-01778-5