Membraanitehnoloogia ja vaktsiini selgitamine (Ⅰ)
Vaktsiinid pärinevad erinevatest allikatest, sealhulgas koeekstraktidest, bakterirakkudest, viirusosakestest, valkudest ja imetajate rekombinantsete rakkude, pärmi- ja putukarakkude poolt toodetud nukleiinhapetest.
Kõige tavalisem vaktsiini valmistamise meetod põhineb esialgsel kääritamisprotsessil, millele järgneb puhastamine. Vaktsiini tootmine on keeruline protsess, mis hõlmab paljusid erinevaid etappe ja protsesse. Õige puhastusmeetodi valimine on soovitud lõpptoote puhtuse saavutamiseks ülioluline. Vaktsiinide selgitamine on oluline samm, millel on oluline mõju toote taastamisele ja sellele järgnevale järgnevale puhastamisele. Vaktsiinide selgitamiseks võib kasutada mitut tehnikat. Kogumismeetodi ja -seadmete valik sõltub aku tüübist, kogutava toote olemusest ja protsessivedelikust. Need meetodid hõlmavad membraanfiltreerimist (mikrofiltreerimine, tangentsiaalne voolufiltreerimine), tsentrifuugimist ja sügavfiltreerimist (tavalise vooluga filtreerimine). Pikaajalise kogemuse põhjal saavutatakse vaktsiinisaagi puhastamine tavaliselt tsentrifuugimise ja sellele järgneva sügavfiltreerimisega.
Viimastel aastatel on vaktsiini selgitamisel esile tõusnud membraanipõhised tehnikad. Eelnevad protsessid kasutavad üha enam ühekordselt kasutatavaid tehnoloogiaid, seega peavad saagikoristusstrateegiad muutuma. See artikkel annab põhjaliku ülevaate erinevatest membraanipõhistest tehnoloogiatest ja nende rakendustest vaktsiini selgitamisel.
01 Sissejuhatus
Vaktsiinid on meie nakkushaiguste ennetamise otsustava tähtsusega osa, mis on endiselt šokeeriv surmapõhjus. Tänu immuniseerimisele päästetakse igal aastal 2–3 miljonit inimest difteeria, teetanuse, läkaköha ja leetrite eest. Vaktsiinid hõlmavad laia valikut, alates väikestest rekombinantsetest valkudest kuni tervete viiruseosakeste ja tervete bakteriteni. Neid võivad toota erinevad süsteemid: munad, imetajarakud, bakterid jne. Vaktsiinide keerukuse ja mitmekesisuse tõttu ei ole praegu ühtegi tavalist puhastusprotokolli ega malli, hoolimata kasvavast huvist vaktsiiniplatvormide vastu.
Tavaliselt võib vaktsiiniprotsessi jagada kolme ossa: ülesvoolu (tootmine ja selgitamine), allavoolu töötlemine (puhastamine, sealhulgas ultrafiltreerimine, kromatograafia ja keemiline töötlemine) ja formuleerimine (lõpliku täitmise toimingud). Tootmissüsteemist sõltumatult mängib selgitamine (soovimatute ainete esialgne eemaldamine) tugeva puhastusprotsessi määramisel võtmerolli. Nõuetekohane selgitamisetapp eemaldab peamiselt terved rakud, rakujäägid, kolloidid ja suured agregaadid, et vähendada järgneva töötlemise koormust. Mõnel juhul võib selgitamine vähendada ka lahustumatuid lisandeid, peremeesraku valke (HCP) ja peremeesraku nukleiinhappeid. Nagu iga teine puhastamisetapp, tuleb ka selgitamisetapp optimeerida, et saavutada maksimaalne saagis ja puhtus, kohanedes samal ajal vaktsiini spetsiifilisuse ja tootmispiirangutega.
Vaktsiinitüüpide heterogeensuse tõttu kasutatakse selgitamiseks mitmesuguseid tehnikaid, sealhulgas tsentrifuugimist või filtreerimist (tabel 1).
Soovitud selguse saavutamiseks on tavaliselt vaja mitut toiminguseeriat. Esimene operatsioon on ette nähtud suuremate osakeste eemaldamiseks (esmane selitamine) ja teine operatsioon on mõeldud kolloidide ja muude submikroniliste osakeste eemaldamiseks (sekundaarne selitamine). Madala kiirusega tsentrifuugimine toimib ühekordse selgitava võimalusena, mis võimaldab rakke ja rakujääke eemaldada sadestamise teel. Tsentrifuugimisega saab hakkama suurte tahkete koormustega ning seda on laialdaselt kasutatud partii- või pidevrežiimis ning ketastsentrifuugides. See nõuab suuri kapitaliinvesteeringuid ja hoolduskulusid ning selle suurendamisel on probleeme usaldusväärse vähendamismudeli puudumise tõttu. Mõned kaubanduslikud vaktsiinitootjad kasutavad aga tsentrifuuge suuremahulises tootmises, mis hõlmab suuri töötlemismahtusid ja suuremat tootmistegevust.
Selgitusfiltratsiooni saab läbi viia tavalise voolufiltratsiooni (NFF, tuntud ka kui ummikfiltreerimine) või tangentsiaalse voolu filtreerimise (TFF, tuntud ka kui ristvoolufiltreerimine). Samuti on olemas spetsiifilised filtrirežiimid (sügavad filtrid), mis sisaldavad positiivselt laetud materjale ja filtri AIDS-i, mis parandavad rakujäätmete, kolloidide ja negatiivselt laetud soovimatute komponentide säilimist.
Membraanfiltrid hoiavad osakesi kinni suuruse välistamise teel ja neil ei ole suurt mustuse kinnipidamisvõimet, seega sobivad need sekundaarseteks selgitamisetappideks. Nii süvafiltreid kui ka membraanfiltreid on lihtne skaleerida ja rakendada (lihtne süsteemi disain). Erinevalt NFF-st kasutatakse TFF-i peamiselt esmasel selgitamisel (mikrofiltratsioonil). Rakkude, rakujäätmete ja muude suurte saasteainete säilitamiseks on edukalt kasutatud membraane, mille piirvahemik on 0.1-0.65 μm (eelistatavalt avatud kanaliga). Enamik TFF-i seadmeid on lineaarselt skaleeritavad ja pärast puhastamist korduvkasutatavad, mis vähendab märkimisväärselt sammu kulumaterjalide maksumust.
Selgitamisetapp jääb ülesvoolu ja allavoolu protsesside vahele ning mõnikord jäetakse see vaktsiiniprotsessi väljatöötamisel tähelepanuta, kuna aeg ja ressursid on prioriteetsed muude puhastamisetappide jaoks, nagu kromatograafia või tihedusgradienttsentrifuugimine.
Isegi vaktsiini tootmisprotsesside patentides jäetakse sageli selgitamisetapp välja. Selgitamise efektiivsus mõjutab otseselt järgneva protsessi toimivust. Halvasti optimeeritud selitamise etapp võib negatiivselt mõjutada steriliseeritud filtri mahtu või lühendada kromatograafilise vaigu kasutusiga. Tänapäeval kipuvad rangemad regulatiivsed ootused vaktsiinitootjaid tootma puhtamaid, hästi iseloomustatud, kuid taskukohaseid vaktsiine. Sel juhul tuleb igale sammule pöörata väärilist tähelepanu. Praegused suundumused viitavad sellele, et ülesvoolu protsess liigub "puhtama" ekspressioonisüsteemi poole (st seerumivabas söötmes kultiveeritud rakud asendavad mune), millel on suurenenud tootlikkus ja suurem rakutihedus.
Lõpptoote puhtuse suurendamiseks lihtsustatakse ja sujuvamaks muudetakse järgnevaid puhastusprotsesse. Nende muudatustega toimetulemiseks ei saa selgitusetapp muutuda kitsaskohaks. Sel juhul vastab filtreerimistehnoloogia uuele selgitamisprobleemile, mis käsitleb protsessi suurema paindlikkuse, ühekordse kasutusvõimaluse ja väiksemate investeerimiskulude probleeme.
02 Viirusvaktsiinide selgitamine
Vaktsiinide sööda lõpus saagi selgitamiseks on edukalt kasutatud mitut tüüpi selgitamismeetodeid, kas eraldi või kombineerituna.
Pilootkaal:1-20L, tootmismaht: üle 20 liitri
2.1 Ettevaatusabinõud viirusvaktsiini selgitamiseks
Paljud vaktsiinid sisaldavad täielikult või osaliselt viiruseosakesi, et moodustada immuunsus viirusnakkuse vastu. Need jagunevad üldiselt nelja suurde kategooriasse:
Nõrgestatud elusvaktsiin (LAV), mis põhineb nõrgestatud viiruse tüvel, et vähendada selle virulentsust. Nõrgestatud viirused võivad kehas paljuneda, kuid ei ole patogeensed.
- Inaktiveeritud viiruse (IV) vaktsiinid, mis sisaldavad nakkavuse kõrvaldamiseks keemiliselt või ultraviolettkiirgusega inaktiveeritud viiruseid. Viiruse osakesed võivad olla terviklikud, jagatud või puhastatud (ainult antigeensed valgud).
- Viirusvektori (VV) vaktsiin on aktiivne, mittepatogeenne viirus, mis esitleb patogeense viiruse antigeeni. Neid hiljuti välja töötatud struktuure kasutatakse ka geeniteraapia rakendustes.
Virus-like particles (VLP-d) vaktsiinid, viiruse allüksuse vaktsiinide spetsiifiline klass, mis jäljendavad viirusosakeste üldist struktuuri, kuid ei sisalda nakkusohtlikku geneetilist materjali.
Enamasti on viiruseosakesed selginemisetapis täiesti terved, isegi viirusvaktsiini lüüsimise ajal (lõhustamine toimub tavaliselt allavoolu, rohkem puhastatud keskkonnas).
Viiruse selgitamise peamine väljakutse on suure saagisega viirusosakeste taastamine, eemaldades samal ajal tõhusalt rakujäägid, suured agregaadid ja lahustumatud saasteained. Nagu on kirjeldatud järgmistes jaotistes, on mitu tegurit, mis võivad põhjustada viiruse lagunemist või kadu. Lisaks võib viiruse saagisele olla raske tugineda, kuna protsessi selles etapis on viiruse kvantitatiivsete analüüsimeetodite suur varieeruvus, eriti LAV- ja VV-vaktsiinide puhul. Nende vaktsiinide puhul hinnatakse viiruse saagikust sageli nakkavustestide abil, nagu naastude test või TCID 50 test. Asjaolu, et mõned kogutud ühendid võivad häirida viiruse võimet nakatada indikaatorrakke, suurendab selle kvantitatiivse lähenemisviisi varieeruvust.
2.2 Viiruse vaktsiini selgitamise strateegia
Viirusvaktsiinid on suuruse, struktuuri, kuju ja ekspressioonisüsteemide poolest väga erinevad (tabel 3).
Seetõttu ei ole selle järgnevate protsesside, eriti selgitamisetappide jaoks üldiselt malli. Teoreetiliselt saab viiruse selgitamiseks valida ja potentsiaalselt kombineerida kõiki olemasolevaid tehnikaid (madala kiirusega tsentrifuugimine, mikrofiltreerimine TFF, NFF). Tegelikult mõjutavad selgitamismeetodite edukust seotud viiruste ekspressioonisüsteem ja füüsikalis-keemilised omadused.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} rakku /ml) katioonseid polümeere kasutav selgitamismeetod vähendas süvafiltratsiooni pindala 4 korda võrreldes traditsiooniliste meetoditega. See meetod võimaldab koguda suure võimsusega fermentereid ilma tsentrifuuge kasutamata. Samamoodi Riske et al. näitas, et 40 l rakukultuuride (0,02%) töötlemine kitosaaniga, mis sisaldas 1.4-2,6% tahkeid aineid, viis pärast sügavfiltreerimist absoluutse filtri võimsuse 7-kordse suurenemiseni.
Nad mainivad ka, et kitosaan näib parandavat selitamise efektiivsust, flokuleerides submikronilisi osakesi, mis tavaliselt settivad tsentrifuugides. Eeltöötlemis- ja flokulatsioonimeetodid jäävad tõenäoliselt ka edaspidi vaktsiinifiltreerimise selgituste osaks. Tungivad ained, sealhulgas suhkrud, glükoolid ja aminohapped, flokuleerivad eelistatavalt viiruseid. Viiruse flokulatsiooni osmootse lahusega, millele järgneb 0.2µ mikrofiltreerimine, saab kasutada tervikliku viiruse puhastamise protsessina. Tungivad ained võivad stimuleerida viiruse agregatsiooni, vähendades osakeste ümber olevat hüdratsioonikihti, et flokuleerida hüdrofoobsed kapseldamata viiruseosakesed ja kapseldatud viirusosakesed. Kuigi on näidatud, et penetrandid flokuleerivad viiruseid, võib see meetod olla platvormiks tulevaseks vaktsiinipuhastuseks ja selle teostatavust vaktsiinide katse- või suuremahulises puhastamises ei ole tõestatud. Flokulatsiooni eeltöötlemise meetod, mis on tõenäoliselt osa tulevasest vaktsiinifiltri selgitamisest, viiakse läbi 2-liitrises fermenteris. Selleks, et neid meetodeid saaks potentsiaalselt kasutada suuremahulistes tootmistoimingutes, tuleb need katse- ja tootmismastaabis valideerida.
2.2.1 Süsteemi mõju väljendamine
Selgitamismeetod sõltub peamiselt ülesvoolu protsessi tüübist ja ekspressioonisüsteemist, mis määrab eemaldatavate saasteainete tüübi ja taseme. Viirusvaktsiine toodavad tavaliselt kanaembrüodes imetajate või lindude pidevad rakuliinid või bakuloviiruse/putuka rakud, mis on keerulisem ekspressioonisüsteem. Teatud tüüpi VLP-sid võivad toota ka teised heteroloogsed ekspressioonisüsteemid (bakterid, pärm, taimerakud).
2.2.1.1 Kana embrüos toodetud viirus
Vaktsiine on munades toodetud aastakümneid. See töö pärineb aastast 1931, mil Woodruff ja good Pasture kasutasid edukalt viljakate munade koorioallantoisi membraani viiruse kasvu substraadina. Tänapäeval toodetakse selle iidse protsessi abil endiselt palju inim- ja veterinaarvaktsiine. Tuntuim on ilmselt hooajalise gripi vaktsiin. Põhimõte on nakatada kanamunad huvipakkuvate viirustega ja seejärel paljuneda koorioallantoismembraanis. Pärast paljunemist kogutakse ja puhastatakse viirusosakesterikas allantoisivedelik.
Allantoisivedelik on väljakutseid pakkuv puhastav toit. Selle kõrge mineraalide ja valgusisaldus (sh ovalbumiin) annab sellele kõrge viskoossuse. Allantoisivedelik sisaldab ka kanaembrüote olulisi koeühendeid, nagu suled, nokad, veresooned või vererakud. Kõrge kuivainesisalduse tõttu on madala kiirusega tsentrifuugimine eelistatud valik esmasel selitamisel, mille tulemuseks on tavaliselt umbes 70% saagis. Siiski on võimalik ka esmane selgitamine filtreerimistehnikate abil. NFF-i jaoks on polüpropüleen- ja tselluloosipõhistel süvafiltritel hea allantoisivedeliku kogumisvõime. Polüpropüleenist või tselluloosipõhistest süvafiltritest valmistatud pinnafiltrite tootlikkus võib olla 150-210 l/m² ja need võivad vähendada toitevoolu hägusust kuni 3 korda. Avatud toitekanali TFF seade sobib ka allantoisivedeliku selgitamiseks, kuna seade on sobivam minimaalse rõhukadu jaoks läbi toitekanali, vähendades seeläbi kanali ummistumist.
Sekundaarset selgitamisetappi saab hõlpsasti teha NFF-iga. Polüpropüleeni, tselluloosi ja klaaskiudmaterjalide kombinatsioon näitab üldiselt head efektiivsust ning alternatiiviks sekundaarsele selitamise etapile on kasutada TFF-i ja {{0}},65 μm või 0,45 μm mikrofiltreerimismembraaniseadet ning kasutada osmootset voogu. kontrolli. Selles etapis saab kasutada avatud kanaliga TFF-seadet hüdrofiilse PVDF-i või hüdrofiilse PES-membraaniga.
Oluline on märkida, et viirusosakesed võivad olla seotud lahustumatu prügiga, mis võib selitamise ajal oluliselt vähendada viiruse tootmist. Soolalahuse kasutamine võib seda seost gripiviiruste ja tahkete fragmentide vahel vähendada, mille tulemuseks on toodangu ligikaudu kahekordne suurenemine, ilma et see mõjutaks viirusosakeste terviklikkust.
2.2.1.2 Järjestikustes imetajate ja lindude rakuliinides toodetud viirused
Viimasel ajal on mõned viirusvaktsiinid eemaldunud munapõhistest protsessidest rakukultuuripõhiste protsesside kasuks (eriti gripivaktsiinide puhul). Selle ülemineku peamine põhjus on vältida embrüonaalsete munadega seotud vaktsiinitootmisprobleeme (st munavarude nappust, mis võib tekkida linnuhaiguse puhangu korral). Selle tulemusena töötatakse praegu välja mitut tüüpi vaktsiine ja viirusvektoreid, kasutades imetajate või lindude pidevaid rakuliine, tavapäraseid rakuliine (nagu Vero, MDCK või HEK293 rakuliinid) või patenteeritud rakuliine.
Olenevalt ekspressioonisüsteemist võib viirus jääda rakusse, nõudes raku lüüsi etappi, või jääda rakust väljapoole (lüüs või pungumine). Rakukultuurist saadav tahke koorem ja lahustuv sisaldus on palju puhtamad kui allantoisi vedelfaas. Tänu sellele on NFF-tehnoloogiat lihtsam rakendada ja võimsus on oluliselt suurem. Filtreerimisvõime sõltub aga suurel määral rakukultuuri tingimustest, nagu rakkude tihedus või rakkude elujõulisus kogumisel. Need parameetrid mõjutavad rakujäätmete ja makroagregaatide hulka, mis võivad ummistada sügavaid filtreid ja membraane, mille tulemuseks on vähenenud võimsus.
Thomassen jt on hea näide NFF-i selgitamisest. Kasutatakse inaktiveeritud polioviiruse (IPV) tootmisprotsessis. Viiruse proliferatsiooniks kasutati mikrokandjatel kasvatatud Vero rakke rakutihedusega {{0}},78 x 106 rakku/ml TOI. Eelselgitamiseks kasutatakse 75 μm roostevabast terasest sõela, et eemaldada saagist mikrokandjad. Kahekihiline sorteerimine selgitatakse tihedusega süvafiltri (02-2,0 μm) abil, millele järgneb steriliseeritud astmefilter.
Valitud skaleeritavat ühekordset seadet kasutati edukalt Sabin IPV kliinilise uuringu materjali valmistamiseks mahuga 350 l. Sõltuvalt viiruse serotüübist saadakse viiruse taastumismäär 86 kuni 96 protsenti.
2.2.1.3 Bakuloviiruse/viirusetaolised osakesed, mis on toodetud putukarakusüsteemis
Bakuloviiruse/putukarakkude süsteemide kaalumine suuremahuliseks vaktsiini tootmiseks on suhteliselt uus, kuid äratab üha suuremat huvi viirusvektorite ja VLP-de vastu. Selle süsteemi peamine eelis seisneb selles, et see hõlmab lühiajalist (pole vaja luua rakuliine) ja ohutut (ei ole täielikku viiruse DNA-d) tootmist. Samuti on mõned puudused, näiteks bakuloviiruse eemaldamise vajadus ja toote stabiilsus.
Cervarix, GlaxoSmithKline'i toodetud inimese papilloomiviiruse nakkuse vastane VLP vaktsiin, on esimene putukarakkudes kaubanduslikult toodetud inimese vaktsiin. Praegu on väljatöötamisel mitmeid bakuloviirusega nakatunud putukarakkudes toodetud VLP-del ja rAAV-vektoritel põhinevaid vaktsiine. Sügisest armeeussist Spodoptera frugiperda (Sf9 ja Sf21) ja kapsast Trichoplusia ni (BTI-TN5B1-4 rakud) pärinevaid putukarakuliine kasutatakse kõige sagedamini nende võime tõttu kasvada suspensioonina, mis lihtsustab ülesvoolu võimendamist. protsessi. Pärast elusrakkude soovitud tiheduseni kasvatamist nakatatakse need rakud valgu ekspressiooniks eksponentsiaalses rakukasvufaasis rekombinantse bakuloviirusega. Bakuloviiruste suur genoom võimaldab ekspresseerida viit või enamat erinevat valku, mis sobib VLP ja viirusvektorite keerukusega.
Bernard et al. kirjeldas putukarakukultuuri allavoolu protsessi. Protsess on väga varieeruv, peegeldades selle tehnikaga toodetud valkude mitmekesisust. Puhastusjärjestuse esimest etappi mõjutavad tugevalt bioreaktori mahuomadused (st rakkude tihedus ja elujõulisus) või toote vabanemise iseloom (sekreteeritakse pungumise või raku lüüsi teel). Putukarakkude bakuloviiruse infektsioon võib põhjustada rakkude lüüsi 3-5 päeva jooksul. Rakkude hävitamine võib viia proteolüütilise aktiivsuse ja muude keskkonnategurite suurenemiseni, mis võivad viia rekombinantsete valkude lagunemiseni.
On tehtud katseid välja töötada bakuloviiruseid, millel on väiksem võime rakkude lüüsi algatada. Bakuloviirus lüüsib vähem kui 10 protsenti nakatunud putukatest.
Rakkude lüüsi saab läbi viia erinevate meetoditega, nagu külmutamine-sulatamine, pesuvahendid, homogenisaatorid või ultrahelitöötlus. Putukarakkudel puudub rakuseina ja seetõttu lahustuvad nad kiiresti. Kuigi ultrahelitöötlusest on teatatud paljudes stendiprotsessides, kasutatakse seda harva eksperimentaalses või kaubanduslikus ulatuses. Kõige tavalisem meetod on homogenisaatori kasutamine rakkude hävitamiseks madala kontsentratsiooniga detergendi (0,1% Triton X-100 või NP-40) juuresolekul. Detergentide ja mikrofluidiseerimise või osmootse mõjuga homogeniseerimise kasutamist on edukalt kasutatud paljudes suuremahulistes tootmisprotsessides. Tavaliselt suspendeeritakse putukarakud lüüsipuhvrites (50 mM TRIS pH 7,7, 300 mM NaCl, 5% glütserool, 0,2 mM PMSF ja proteaasi inhibiitorid), mille käigus Triton-X100 lisatakse lõppkontsentratsioonini 0,1%, millele järgneb kerge ultraheli või mikrofluidiseerimine. Seejärel segu tsentrifuugitakse lahustumatute osakeste eemaldamiseks.
Selles etapis võib lüsaat tunduda väga hägune ja seda on 0,45 μm filtriga raske filtreerida. Mõnikord võib pürolüüsi selgitamise etapis täheldada kuni 30% kadusid. Bensoensüümide lisamine lõhustamisetapis aitab lahendada filtreerimisprobleemi. Rakkude puhastamine fosfaatpuhverdatud soolveega pärast koristamist ja kiire "külmutamine-sulatamine" kõrge soolasisaldusega (500 mM NaCl), mis sisaldab krakkimispuhvrit, aitab eemaldada agregaate.
Putukarakkude poolt toodetud VLP-de ja viirusvektorite selginemine toimub pärast rakkude lüüsi (keemilise või mehaanilise töötlemisega), mille käigus vabaneb lisaks viiruseosakestele ka suur hulk raku nukleiinhapet. Putukarakud on võimelised kasvama suure rakutihedusega alates 1-9.10 6 rakust/ml. Seetõttu peaks selgitamise etapp käsitlema suurt rakutihedust, kõrget nukleiinhapete sisaldust ja võimalusel bakuloviiruse osakeste eemaldamist. Asja keerulisemaks muutmiseks võivad VLP-d ehk viirusvektorid ja bakuloviirused olla sarnase suurusega (baculoviirused on 60-80 nanomeetrit laiad ja 300-400 nanomeetrit pikad). Rakkude suure tiheduse tõttu on tsentrifuugimine olnud aastakümneid eelistatud meetod esmasel selgitamisel. Kuid membraaniprotsessid tunduvad olevat väga atraktiivsed alternatiivid, kuna skaleeritavust on lihtne määratleda.
Sügavfiltreid on tõhusalt kasutatud kolmekihiliste rotaviirusetaoliste osakeste protsessis. Laboratoorsel tasemel kasutatakse nende kompleksosakeste puhastamiseks sageli CsCl tihedusgradiendi ultratsentrifuugimise meetodit. Teadlased hindasid mitte ainult süvafiltri selgitamisetappi, vaid ka kogu allavoolu protsessi (Triton X-100 lõhustamine ja sügavfiltreerimine, millele järgnes ultrafiltreerimine ja osakeste suuruse välistamine). Tulemused näitavad, et CsCl tihedusgradiendi saagis võib ulatuda 37% -ni.
Ultratsentrifugaalmeetod on umbes 10%. Teise näitena kasutati putukarakkudes toodetud HIV-laadsete osakeste taastamiseks ja kontsentreerimiseks 0, 45 μm õõnsaid kiude ja 500 kDa peene läbimõõduga kiude. Selles uuringus optimeeriti õõnsate kiudude nihkejõudu raku terviklikkuse alusel. Tulemused Lauasuhkru gradiendiga ultratsentrifuugimise asendamiseks loodi madala nihkejõuga protsess.
Protsessi saab rakendada masstootmises. Sügavfiltreid on edukalt kasutatud ka rekombinantsete adeno-assotsieerunud viiruste tootmisel. Rakkude lüüs viidi läbi kahe kolviga mehaanilise rakusummeriga, millele järgnes nukleaasitöötlus. Selgitamise etapis kasutati 1,2 μm klaaskiust süvafiltrielementi, millele järgnes kaks kihti 0,8 μm hüdrofiilset PES-i ja 0,2 μm hüdrofiilset PES-i. Proportsionaalse suurusega filtreid kasutatakse väiksemate kuni 200 L suuruste protsessipartiide jaoks. Sügavfiltreid on edukalt kasutatud ja TFF-i reitingud lamedate kilede või õõneskiududega 0,2 µm või 0,45 µm on samuti väga tõhusad.
Tecnologica (IBET) uuringus Oeirase eksperimentaalse bioloogia instituudis Portugalis kasutati NFF-i bakuloviiruste poolt ekspresseeritud C-hepatiidi VLP selgitamiseks ilma tsentrifuugimiseta. VLP koristamise selgitamiseks kasutatakse nimiväärtusega polüpropüleenfiltreid (10,5,0,6 ja 0,3 μm). VLP kogumiskeskustes kasutatakse filtreerimiseks samu filtreid, mille pooride suurus on 0,6 μm ja 0,3 μm. Kõiki uuritud filtraate testiti HCV-VLP taastumismäärade suhtes ja võrreldi soovitatud filtreerimismeetodeid. Tulemused on toodud tabelis 4.
Tulemused näitasid, et 5 μm-0 0,3 μm filtril oli otse kogutud C-hepatiidi VLP sööda puhul suurim toote taastumine (100%). Polüpropüleenist 0, 6 μm filtril oli tsentraalse sööda jaoks suurim saadus (82%) ja peremeesraku DNA kliirens oli umbes 70%.
2.2.1.4 Bakteri- või pärmisüsteemides toodetud viirusetaolised osakesed
Bakteri- või pärmisüsteemides ekspresseeritud VLP-vaktsiinide selgitamismeetodi tüüp sõltub VLP vabanemisest rakuvälistesse vahendajatesse. Kui VLP-sid ei saa tõhusalt sekreteerida, võib enne tegelikku selgitamisetappi vaja minna rakkude lüüsi või muid ekstraheerimisetappe. Kuigi see on valgu selgitamise tööstuse kuldstandard, tsentrifuugimine (pidev või partii), mida väljendatakse bakteriaalsetes või pärmipõhistes süsteemides, on viimasel ajal membraaniprotsessid muutunud väga atraktiivseks alternatiiviks tänu nende hõlpsale skaleeritavusele ja ühilduvusele ühekordse kasutusega süsteemides. ravimeetodid.
Richter ja Topell selgitavad tsentrifuugimise, TFF-i või mõlema kombinatsiooni kasutamist selitatud E. coli-s toodetud VLP-de valmistamisel. Nende töös kasutati 0,45 m TFF membraane homogeniseeritud E. coli homogenaatide lahjendamiseks ja selgitamiseks temperatuuril 5 kraadi. Samuti märgivad nad, et membraanipõhine TFF sobib kõrge viskoossusega saagi töötlemiseks, eelistatavalt avatud kanalikonfiguratsiooniga TFF-seadmete kasutamisel.
Tsentrifugaalselgitamist on hinnatud ka TFF-i alternatiivina. Sel juhul saadud homogenaati ei lahjendatud ja tsentrifuugiti 4 kraadi juures 105 minutit, 10000g. Ilma pehmet katet üle kandmata valati supernatant osakestest välja ja tsentrifuugiti uuesti 4 kraadi ja 10 000 g juures 60 minutit. Seejärel eemaldati olemasolevatest osakestest supernatant, lahjendati EB puhvriga (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris alus, 5,0 mM EDTA, 10% (maht/maht) Triton X-100) 1:2 ja filtreeriti. 0,22 m steriilsel filtriseadmel. Edasine töötlemine. Väidetavalt selgitati tsentrifuugimise ja TFF-i kombinatsiooni abil selle VLP-vaktsiini tootmise suurendamise protsessi E. coli-s 800-liitrises mahus.
Rekombinantne E-hepatiidi vaktsiin HEV 239 on Hiinas litsentseeritud 16-aastaste ja vanemate täiskasvanute immuniseerimiseks. Vaktsiini antigeene (VLP) ekspresseeritakse E. coli-s ja on näidatud, et antigeeni tootmisprotsessi ulatus on 50L. Produkt ekstraheeriti E. coli krakkimise teel ja inklusioonkehad eraldati rakufragmentidest tugeva pesemisega puhvriga, mis sisaldas 2% Triton X-100, ja lahustati seejärel 4 M uurea homogenisaatoris. TFF selgitab inimese papilloomiviiruse VLP-d, mis on toodetud Saccharomyces cerevisiae's (15 l). Nukleaasiga töödeldud rakulüsaat selgitati ristvoolu mikrofiltreerimisega transfiltratsioonirežiimis, kasutades 0, 65 μm õõneskiudfiltrit. Sama protsessi kasutatakse vaktsiini tootmisel. Kuigi kaubanduslikule tasemele on jõudnud vaid käputäis VLP-põhiseid vaktsiine, on väljatöötamisel mitmeid VLP-põhiseid vaktsiine, millest enamik selgitatakse tsentrifuugimise või membraanitehnoloogia abil.
Piiratud ruumi mõjuga, jagame järgmises peatükis sisu teist poolt. Järgmises artiklis jagame mõningaid vaktsiini selgitamise juhtumeid ja asjakohaste membraanikomponentide kasutamist.
Esimese ettevõttena lokaliseerimisahelas on Guidling Technology kogunud piisavalt asjakohast kogemust vaktsiinide selgitamisel. Guidling Technology on arendus- ja tootmisettevõte, mis keskendub biofarmatseutilisele ja rakukultuurile, puhastamisele ja eraldamisele. Tooteid kasutatakse laialdaselt biomeditsiinis, diagnoosimisel, tööstusliku vedeliku filtreerimise, tuvastamise, selgitamise, puhastamise ja kontsentreerimise protsessis; Guidling on edukalt välja töötanud ultrafiltratsiooni tsentrifuugitoru, ultrafiltratsiooni/mikrofiltratsiooni membraanikasseti, viiruse eemaldamise filtri, tangentsiaalse voolu filtri seadme, sügava membraanivirna jne, mis vastavad täielikult biofarmatseutilise ja rakukultuuri rakendusstsenaariumidele.
Meie membraane ja membraanfiltreid kasutatakse laialdaselt eelfiltreerimise, mikrofiltreerimise, ultrafiltratsiooni ja nanofiltratsiooni kontsentreerimiseks, ekstraheerimiseks ja eraldamiseks. Meie lai tootevalik, alates väikesest ühekordselt kasutatavast laboratoorsest filtreerimisest kuni tootmistüüpi filtreerimissüsteemideni, steriilsuse testimise, kääritamise, rakukultuuri ja muuga, vastab testimise ja tootmise vajadustele.
