Uuring traditsioonilise kolonnkromatograafia asendamise kohta membraankromatograafiaga monoklonaalsete antikehade puhastamiseks

traditsiooniline pakitud -kihtkromatograafia on küps ja usaldusväärne, kuid seda piiravad piirangud, nagu madal difusioonitõhusus, kõrge vasturõhk ja aeglane töötlemiskiirus, mistõttu on järjest raskem sammu pidada ülesvoolu protsesside pidevalt kasvava tootlikkusega. Hiljuti avaldati aastal uuringBiotehnoloogia arengon toonud tööstusesse potentsiaalse läbimurde: oma erakordselt kõrge tootlikkuse ja tugeva vastupidavuse eelistega võib membraankromatograafia saada tõhusaks alternatiiviks pakitud -kihtkromatograafiale ja kujundada põhjalikult ümber monokloonsete antikehade allavoolu puhastamise maastikku.

Uurimise taust

 

Uuringus hinnati süstemaatiliselt erinevat tüüpi membraankromatograafiaseadmeid, sealhulgas ioonivahetus- ja valgu A-afiinsusmembraane, ning viidi läbi põhjalik võrdlus traditsioonilise pakitud-kihtkromatograafiaga mitmes mõõtmes, sealhulgas sidumisvõime, lisandi kliirens, kasutusiga ja üldine puhastusvõime. Uuringu jaoks valiti kolm rekombinantset valku -üks monoklonaalne antikeha (mAb) ja kaks Fc-sulandvalku-, mis hõlmasid kogu allavoolu puhastusprotsessi alates püüdmisest kuni poleerimiseni. Peamised testitulemused on järgmised:

 

1. Püüdmise etapp: Protein A membraankromatograafia - kõrge sidumisvõime lühikese viibimisaja juures

Valgu A kromatograafia on mAb püüdmise kriitiline etapp. Uuringus hinnati nelja Protein A membraani (kolm kaubanduslikku toodet ja üks membraani prototüüp) toimivust kahe võrdlusaluse -kihtvaigu suhtes:

• Suurepärane dünaamiline sidumisvõime (DBC):Kaks membraani saavutasid DBC väärtused üle 50 g/l. Mõned membraanid säilitasid sidumisvõime 35–65 g/l isegi ülilühikese, 0,2-minutise viibimisaja juures, mis on võrreldav traditsiooniliste pakitud -kihtvaikudega (37–55 g/l).
• Dramaatiline tootlikkuse tõus:Membraankromatograafia viibimisaeg oli vaid 1/6–1/30 traditsioonilise kolonnkromatograafia omast (0,13–0,33 min vs . 2–6 min), mille tulemuseks oli12–35-kordne partiitöötluse tootlikkuse kasv.
• Stabiilne taastumine:Valgu taastumine ületas kõigi membraaniseadmete puhul 85%. GORE membraan saavutas suurima taastumise 96%, mis on põhimõtteliselt võrreldav traditsiooniliste pakitud -kihtvaikudega (94–98%).
• Piirangud, mida tuleb arvestada:Membraankromatograafia andis elueerimismahu1,4-5 korda kõrgemkui traditsioonilised pakitud{0}}voodivaigud, samas kui HCP kliirens oli pisut madalam. Mõne membraani puhul ulatus HCP tase eluaadis 7000 ppm-ni, võrreldes 4700 ppm-ga traditsiooniliste pakitud -kihtvaikude puhul. Seetõttuselle piirangu kompenseerimiseks võib vaja minna täiendavaid poleerimisetappe.

 

2. Poleerimisetapp: ioonivahetus-/multimodaalsed membraanid - tõhus lisandite eemaldamine kiire töötlemisega

Poleerimisetapi peamine eesmärk on eemaldada jääklisandid, nagu suure -molekulaarse- massiga (HMW) agregaadid ja peremeesraku valgud (HCP). Uuringus hinnati kolme tüüpi membraankromatograafiat: anioonivahetus (AEX), katioonvahetus (CEX) ja multimodaalne (MM) membraan.

• Rekordiline{0}}tootlikkus:Membraankromatograafia viibimisaeg oli ainult0,17 min, võrreldes2–4 mintraditsioonilise kolonnkromatograafia jaoks, mis esindab a12–24-kordne viibimisaja lühenemineja töötlemise tõhususe järsk tõus.
• Lisandite eemaldamine on võrreldav traditsioonilise kolonnkromatograafiaga:Membraankromatograafia saavutatudHMW kliirenstegurid 4,2–5,5, läheneb Capto Adhere vaigu (6) jõudlusele. TheHCP kliirensitegur jõudis 60-ni, kus mõned membraanid on paremad kui traditsiooniline pakitud{0}}kromatograafia.
• Konkurentsivõimeline valgu taastamine:Enamik membraane saavutatudvalkude taastumine üle 90%ja mõnede Fc-sulandvalkude puhul oli saagis isegi suurem kui traditsioonilise kolonnkromatograafiaga.

 

3. Täielik-Protsessi valideerimine: membraankromatograafia võimaldab kõrge-puhtusega puhastamist

Uuringuga tehti kindlaks anintegreeritud membraani{0}}põhine puhastusprotsess, mis ühendab A-valgu püüdmise poleerimisegaja võrdles seda otse tavapärase pakitud{0}}kromatograafia protsessiga:

• Kõrge{0}}puhtusastmega jõudlus:Pärast täielikku membraani{0}}põhist puhastusprotsessi vähendati HCP taset Fc-liitvalkudes kunialla 50 ppm, täitematerjalidega (HMW liigid) juuresVähem kui 0,5% või sellega võrdne. Monoklonaalse antikeha puhul vähendati HCP väärtuseni226 ppm, agregaatidega aadressil1.0%, läheneb tavapärase pakitud -kromatograafia protsessi jõudlusele (11 ppm HCP ja 0,7% agregaate).
• Suurem üldine taastumine:Fc-liitvalgu üldine taastumine saavutati89%, mis oli19% kõrgemvõrreldes tavapärase pakitud{0}}kromatograafia protsessiga. Monoklonaalse antikeha puhul oli taastumine73%, mis on võrreldav tavapärase pakitud{0}}voodiprotsessiga.
• Tugev saastumiskindlus:Membraankromatograafia näitas paremat taluvust suure lisandisisaldusega lähteainete suhtes ja jäi tõhusaks isegi siis, kuiHCP esialgne kontsentratsioon jõudis 150 000 ppm-ni.

 

4. Kasutusiga: stabiilne töö 100+ tsüklite jaoks vastab tootmisnõuetele

Membraani vastupidavus on tööstuslikuks kasutamiseks kriitiline tegur. Uuringus hinnati membraani stabiilsust läbi201 järjestikust töötsüklit:

• Pikendatud tsükli eluiga:Kaheksast membraanist seitse valmisrohkem kui 100 tsüklit, samas kui prototüübi multimodaalne (MM) membraan jõudis201 tsüklitilma jõudluse olulise halvenemiseta.
• Stabiilne jõudlus:Kogu jalgrattasõidu uuringu ajalvalkude taastumine püsis umbes 90%, mille HMW või HCP eemaldamise jõudlus ei ole oluliselt vähenenud. Ka surveprofiilid jäid stabiilseks.
• Sobib tootmisrakendusteks:Enamik membraane oli võimeline toetamavähemalt üks täielik tootmistsükkel, samas kui mõned võivad toetada mitut partiid. Kuhjunud rõhu tõusu saab leevendada, optimeeridespuhta-koha-(CIP) strateegia.

 

Tehnilised tipphetked: miks võib membraankromatograafia asendada traditsioonilist kolonnkromatograafiat?

Membraankromatograafia peamised eelised tulenevad selle ainulaadsest lame{0}}lehtmembraani struktuurist. Võrreldes tavaliste poorsete kromatograafiavaikudega on membraankromatograafial kolm peamist erinevust:

1. Uuenduslik massiülekandemehhanism:Membraanid toetuvad peamiselt konvektiivsele massiülekandele, välistades vajaduse valkude difundeerumiseks poorsesse keskkonda. See vähendab oluliselt viibimisaega ja võimaldab palju kiiremini töödelda.
2. Oluliselt madalam vasturõhk:Lame{0}}lehe struktuur tagab madala voolutakistuse ja suudab taluda suuremaid voolukiirusi, ületades traditsioonilise kolonnkromatograafiaga tavaliselt seotud vasturõhu piirangud.
3. Tugev protsessi kohandatavus:Membraankromatograafia ühildub pideva tootmisega ja sobib paremini ülesvoolu protsesside kõrge tootlikkusega. Lisaks võivad selle väiksem seadmete jalajälg ja väiksemad membraankandja nõuded aidata vähendada üldisi tootmiskulusid.

Muidugi on membraankromatograafial ka teatud piirangud. Nende hulka kuuluvadsuuremad elueerimismahud, mis nõuavad täiendavat puhvri tarbimist; vajadus lisanditest puhastamise edasiseks parandamiseks selliste proovide jaoks, nagu proovidbispetsiifilised antikehad (bsAbs); ja mõnede membraanitoodete piiratud kättesaadavus suurtes tootmismahtudes. Neid väljakutseid saab aga järk-järgult lahendada seadmete optimeeritud disaini, täiendavate sügavus{1}}filtreerimise etappide ja muude protsessitäiustuste abil.

Mõju tööstusharule: monoklonaalsete antikehade tootmine on jõudnud suure{0}}tõhusa puhastamise ajastusse

Selle uuringu tulemused annavad biofarmatseutilisele tööstusele selge suuna tehnoloogiliseks arenguks. Tavapäraste monoklonaalsete antikehade ja Fc-sulandvalgu puhastamise protsesside puhul, mis seavad esikohale kõrge tootlikkuse,membraankromatograafia võib täielikult asendada traditsioonilise täidiskolonnkromatograafia-. Isegi keerukamate lähteainete puhul võib kombineeritud strateegia, mis kasutab membraankromatograafiat koos tavapäraste kromatograafiavaikudega, aidata saavutada optimaalset tasakaalu töötlemise tõhususe ja toote puhtuse vahel.

Kuna membraanimaterjalide tehnoloogiad arenevad edasi, peaksid tulevased arengud veelgi vähendama puhvri tarbimist ja parandama mastaapsust, kiirendades biofarmatseutilise tööstuse arengut.pidev, kõrge{0}}tõhus ja kulutõhus{1}}tootmine.

Bioravimite tootjatelemembraankromatograafia varajane kasutuselevõtt ja strateegiline kasutuselevõtt võib muutuda areneval turul oluliseks konkurentsieeliseks.