Veretoodete inaktiveerimise ja viiruse eemaldamise tehnoloogia

Veretooted on "plasmavalgu komponendid või vererakkude komponendid, nagu inimese vere albumiin, inimese immunoglobuliin, inimese hüübimisfaktori (looduslik või rekombinantne) punaste vereliblede kontsentraat jne, mis on eraldatud terve inimese plasmast või spetsiifiliselt immuunplasmast, puhastatud või valmistatud rekombinantse DNA tehnoloogia abil diagnoosimiseks, raviks või passiivseks immunoprofülaktikaks". Veretooted mängivad olulist rolli meditsiinilises hädaolukorras, sõjavigastuste päästmisel ning teatud haiguste ennetamisel ja ravis.

 

Regulatiivne taust

Ohutuse tagamise tavad peavad tagama, et lõplik ravim on reguleerijatele ning lõpuks ka patsientidele ja avalikkusele ohutu. 1990. aastatel andis rahvusvaheline koordineerimiskonverents (ICH 1998) välja "Q5A: Inim- või loomapäritolu rakuliinide biotehnoloogiliste toodete viirusohutuse hindamine" (Q5A: Viral Safety Assessment), millega kehtestati ülemaailmne viirusohutuse standard.

ICH Q5A kirjeldab selle eesmärgi saavutamiseks mitmetasandilist testimise ja kinnitamise skeemi. Testiprogramm keskendub rakupanga, tooraine ja bioreaktori kogumisele, mida täiendab toote riskianalüüs. Lisaks testimisele nõuab ICH Q5A, et allavoolu saastest puhastamist hinnataks tõrkekindla meetmena, kui ülesvoolu saasteaineid ei tuvastata. Kliirensi kontrollimine tagab, et kui mõni viirus testimisrežiimist kõrvale hiilib, saab selle eemaldada ja/või inaktiveerida enne lõppravimisse sattumist.

 

Üldise viirusetõrjeprogrammi taust

Kaasaegses biotehnoloogia tootmises (või biotöötlemises) on kogu puhastatud järjestuses tavaliselt kolm või neli ühikulist operatsiooni, mis on võimelised viirust eemaldama või inaktiveerima. See hõlmab teatud kromatograafilisi etappe (nagu proteiin A või anioonivahetus), madala pH-taseme või detergentide kasvatamist ja viiruse retentsioonifiltreid. Kõik need sammud ei eemalda ega inaktiveeri tõhusalt kõiki viirusi.

Näiteks madala pH-ga kultuur on tavaliselt ümbristamata viiruse inaktiveerimiseks ebaefektiivne, kuid see toimib hästi ümbrisega viiruse inaktiveerimiseks. Teatud töötingimustes ei pruugi anioonivahetuskolonn olla võimeline neutraalseid isoelektrilisi viiruseid siduma ja tootevoost eemaldama, kuid see on tõhus happeliste viiruste vastu.

See on kombinatsioon kolmest kuni neljast sõltumatust ja ortogonaalsest üksuse operatsioonist, mis koos tagavad biotehnoloogiatoodete viirusohutuse.

 

Üldiselt eeldatakse, et jõuline, tõhus ja usaldusväärne töötlusetapp suudab eemaldada või inaktiveerida suure hulga viirusi (tavaliselt defineeritakse kui 4 log10 või rohkem, kus logaritmi vähenemise väärtus või LRV arvutatakse kui log10 koguarvust sisendis olevate viiruste arv jagatud väljundis olevate viiruste koguarvuga). Siiski ei saa LRV-d kasutada sammu tõhususe ühe absoluutse mõõdikuna. Andmed võivad olla esialgsed. Seda on lihtne modelleerida, see on protsessitingimuste muutuste suhtes suhteliselt tundetu ja tõhus paljude viiruste vastu (WHO 2004).

Viiruse filtreerimine on laialdaselt tunnustatud kui selline võimas ja tõhus protsessietapp ning see on üldise strateegia põhikomponent, mille eesmärk on minimeerida eksogeensete ja endogeensete viirusosakeste oht biotehnoloogiatoodete valmistamisel.

Viirusfiltrid töötavad sageli tugevate, suurusepõhiste säilitusmehhanismide kaudu. Selle võimsa toimemehhanismi alusel tagavad viirusfiltrid tõenäolisemalt kui kromatograafilised etapid prognoositava viiruse retentsiooni paljude viiruste jaoks. Selle põhjuseks on asjaolu, et filtrit mõjutavad väiksema tõenäosusega erinevate viiruste füüsikalis-keemiliste omaduste erinevused ning viiruse ja vaigu vastastikmõjud, mida reguleerivad töötingimused. Seetõttu kasutatakse viiruse filtreerimise etappi tavaliselt hästi läbimõeldud rekombinantsetes terapeutilistes valkude puhastamise protsessides (EMEA 1996), millel on samuti tõestatud tugev jõudlus plasmatöötlustööstuses.

 

Veretooted on aga nagu kahe teraga mõõk, mis mitte ainult ei päästa tuhandeid inimelusid, vaid võib ka haigusi levitada ja inimeste tervisele ohtu kujutada. Statistika kohaselt sai aastatel 1977–1984 vähemalt 30,000 Ameerika Ühendriikides veresaajat AIDS-i viirusega nakatunud verd. 1985. aastal nakatus Prantsusmaal 1200 hemofiiliahaigest 3-st vereülekande või veretoodete kaudu AIDS-i.

Maailma Terviseorganisatsiooni andmetel on 5–10% AIDS-i nakatumistest maailmas põhjustatud AIDS-iga nakatunud vere või veretoodete ülekandmisest. Esimene AIDS-i juhtum Hiinas nakatati AIDS-i viirusega nakatunud imporditud veretoodete kasutamisega. Lisaks on teatatud ka B- ja C-hepatiidi haiguste edasikandumisest vere ja veretoodete ülekande tõttu.

 

1. Peamised veretoodetega levivad viirused ja nende omadused

Vere ja veretoodete kaudu levivaid viiruseid on mitut tüüpi, nagu on näidatud tabelis 1. Nende hulgas on kodu- ja välismaised meditsiiniringkonnad mures olnud HIV, HBV ja HCV pärast nende kõrge nakatumismäära ja tõsiste kahjude tõttu.

Kuna verel ja veretoodetel on võimalus viiruseid levitada, on see tõsiselt mõjutanud selle kasutamist haiguste ennetamisel ja ravis. Seetõttu tuleb veretoodete valmistamisel lisada veretoodete ohutuse tagamiseks viiruste inaktiveerimise ja eemaldamise protsesse.

2. Peamised viiruse inaktiveerimise ja eemaldamise meetodid

Veretoodete ohutuse tagamiseks on lisaks veredoonorite valikule, võimalusel immuniseerimisele ning kogutud vere rangele testimisele ja muudele meetmetele oluline lüli veretoodete viirusravi inaktiveerimine ja eemaldamine. vereülekande ohutus. Allpool kirjeldatakse üksikasjalikult mitmeid levinud ja tõhusaid meetodeid viiruste inaktiveerimiseks ja eemaldamiseks.

 

I. Viiruse inaktiveerimise meetodid

1. Pasteuri meetod

Selle meetodi teoreetiline alus seisneb selles, et viiruse struktuuri hävimiskiirus on temperatuuri ja toimeaja valiku tõttu palju suurem kui valgu struktuuri hävitamise kiirus. Ligi 50-aastased kliinilise kasutuse tulemused ja hiljutised loomkatsed on kinnitanud, et albumiin lahuses pärast 60-kraadist 10-tunnist kuumtöötlust, st Pasteuri desinfitseerimist, ei suuda mitte ainult inaktiveerida HBV-d, vaid ka inaktiveerida HCV-d ja HIV-i, muutes albumiini kõige usaldusväärsemaks. veretoode viirusohutus.

Hiljuti on Pasteuri protsessi laiendatud IVIG, FVI, FIX, fibrinogeeni ja muude toodete tootmisele. Bridonnccu et al. lisas selle viiruse inaktiveerimisprotsessi madala temperatuuriga etanooli tootmise IVIG protsessile, st Pasteuri meetodit rakendati tingimustes, kus ei olnud stabilisaatorit, madal soolasisaldus ja happesus ning viiruse tiiter vähenes 5 log võrra. Simmonds et al. testis Ühendkuningriigis kliiniliselt kasutatavate FVⅢ ja FIX kontsentreeritud preparaatide transfusiooni teel levivat viirust (TTV) ning leidis, et Pasteuri viirust inaktiveerimata toodete TTV tuvastamise määr oli 50% kuni 75% ja positiivne avastamismäär toodete arv pärast Pasteuri inaktiveerimist oli 0.

Ühendkuningriigis 84 hemofiiliaga patsiendil, kes kasutasid inaktiveerimata hüübimisfaktori tooteid, oli TTV positiivne määr 27%, samas kui 19-st viirusega inaktiveeritud hüübimisfaktori tooteid kasutanud patsiendist oli ainult 1 positiivne, positiivse avastamise määr oli 5%. Seetõttu on viiruse inaktiveerimise protsess veretoodete ohutuse parandamisel väga tõhus.

 

2. Pindaktiivse ainega kombineeritud orgaaniline lahusti (S/D meetod)

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%. Paljud S/D-meetodil inaktiveeritud veretooted on osutunud pikaajalise kliinilise kasutusega ohutuks ja usaldusväärseks, mistõttu neid kasutatakse laialdaselt. Sellel meetodil ei ole aga inaktiveerimisvõimet parvoviiruse B19, HEV ja teiste lipo-katteta viiruste vastu.

 

3. Kuiva kuumuse inaktiveerimise meetod

Kuiva kuumusega inaktiveerimine tähendab, et lüofiliseeritud preparaati töödeldakse kuumutamisega ja viirus tapetakse kuiva kuumusega. Tavaliselt kasutatavad kuivkuumuse meetodid on 60 kraadi ~80 kraadi, 10~72 h kuumutusmeetod ja 80 kraadi, 72 h töötlemismeetod. Juba 1980. aastate alguses oli kasulik FVIII lüofiliseeritud kontsentreeritud preparaati ja protrombiinikompleksi kuumutada 60-80 kraadi juures 10-72 tundi. Siiski on tõestatud, et see meetod ei suuda täielikult inaktiveerida HBV-d, HCV-d, HIV-i. Kuivkuumtöötlus temperatuuril 80 kraadi ja 72 tundi on osutunud tõhusaks HBV, HCV ja HIV inaktiveerimisel. Hiljuti on teatatud ka lüofiliseeritud hüübimisfaktorite preparaatidest, mida on töödeldud 100 kraadi juures. Xu Jinbo jt ravisid IgG-d 100 kraadi juures 30 minutit ja inaktiveerisid vesikulaarse stomatiidi viirust 8.2 Log. Mõned inimesed külmutavad kuivatatud FVIII 68 kraadi juures 72 tundi kuivas olekus ja seejärel kuumutatakse 100 kraadi juures 0,5–1 h. See meetod on suhteliselt ökonoomne.

 

4. Fotokeemiline meetod

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 HIV-ga seotud rakkude logi ja trombotsüütide arv püsis hea pärast 7-päevast funktsionaalset säilimist in vitro, mille FDA on kliinilisteks uuringuteks heaks kiitnud.

Nende meetodite hulgas on Pasteuri desinfitseerimismeetod ja S/D meetod Ameerika Ühendriikide FDA poolt heaks kiidetud ja neid kasutatakse maailmas laialdaselt. Kuiva kuumusega inaktiveerimise meetod sobib peamiselt lüofiliseeritud preparaatide viiruse inaktiveerimiseks. Fotokeemilisel meetodil on tugev inaktiveeriv toime lipiidkattega viirustele ja seda on Euroopas kasutatud terve plasma viiruse inaktiveerimiseks ning sellel on laialdased väljavaated viiruse inaktiveerimiseks vererakkude komponentides. Kõigil neil meetoditel on aga omad puudused, nt Pasteuri steriliseerimine ei ole ideaalne mõne kuumakindla viiruse inaktiveerimiseks; S/D meetod ei suutnud tõhusalt inaktiveerida lipo-katteta viirust. Fotokeemiline meetod kahjustas oluliselt mõnede plasmavalkude aktiivsust. Järeluuringute praegune kliiniline kasutamine näitab, et ükski viiruse inaktiveerimismeetod ei taga, et veretooted on täiesti vabad viiruste edasikandumise ohust.

 

I. Viiruse eemaldamise protsess

Veretoodete valmistamisel ei saa üks inaktiveerimisprotsess inaktiveerida kõiki viirusi; Lisaks on viirus ise heteroloogne valk, näiteks toote sisestamine põhjustab kõrvaltoimeid; Samas on tehnilise taseme piiratuse tõttu endiselt viiruseid, mille omadusi ei leita ega mõisteta, mistõttu olemasolevad viiruste inaktiveerimismeetodid ei suuda tagada nende viiruste inaktiveerivat toimet. Seetõttu ei saa inaktiveerimine üksi tagada toote ohutust ja see tuleb tootest eemaldada. Seega pööratakse viiruse eemaldamise tehnoloogiale üha rohkem tähelepanu. Allpool kirjeldatakse lühidalt kahte sageli kasutatavat ja tõhusat viiruse eemaldamise protsessi.

1. Kromatograafia tehnoloogia

Kromatograafiatehnoloogia viitab erinevate komponentide ja statsionaarse faasi afiinsuse või interaktsiooni erinevuste kasutamisele erinevate komponentide eraldamise saavutamiseks. Veretoodete tootmise arenenud tehnoloogiana on kromatograafial endal viiruseid eemaldav toime, eriti afiinsuskromatograafia ja ioonivahetuskromatograafia. Ioonivahetuskromatograafia puhul on elueerimisel eelised viiruse eemaldamisel läbitungimise ees. Tabelis 2 on toodud andmed HAV-i eemaldamise kiiruse kohta kromatograafilise tehnoloogia abil Austraalias CSL Company albumiini tootmise protsessis. Nagu on näha tabelist 2, on ioonvahetuskromatograafia ja geelfiltreerimine HAV-i eemaldamisel tõhusamad, kogueemalduskiirusega 10,9 log.

FVIII tootmisel teostab Baxter Healtheare immunoafiinsuskromatograafiat, kasutades anti-FVIII antikehaga töödeldud geele, mis suudavad eemaldada (4,2±0.1)logi ja (5,3±0.9)logi mitte- -lipiidkattega viirused, nagu vastavalt PPV ja HAV.

 

2. Nanokile filtreerimine

Mõnede väikese pinnadiameetriga viiruste (nt HAV ja parvoviirus B19) puhul on nanomembraanfiltreerimine kõige tõhusam eemaldamismeetod. See kasutab ära valkude ja viiruste suuruse erinevust ning viiruste adsorptsiooni filtrimembraani poolt viiruste isoleerimiseks. Madalmaades Sanquin Blood Supply Site viidi läbi laboriuuring viiruste eemaldamiseks, lisades protrombiinikompleksi tootmisprotsessile üheetapilise kaheetapilise Planova 15N nanomembraanfiltratsiooni. Leiti, et HIV, HAV ja teiste viiruste eemaldamise määr suurenes pärast nanomembraanfiltreerimist erineval määral (vt tabel 3).

Selle meetodi kasutamisel tööstuslikul tootmisel võivad siiski tekkida järgmised probleemid: Esiteks, toote kõrge viskoossuse ja suure läbimõõduga valkude olemasolu tõttu ei tohiks filtri poolt valitud membraani pooride suurus olla liiga väike, piirates seega väikese läbimõõduga viiruste nagu HCV eemaldamist; Teiseks mõjutab membraani pooride suuruse kontrolli stabiilsus filtrite tootmise protsessis viiruse eemaldamist. Kolmandaks, kui viiruseosakese läbimõõdust väiksem membraani ava on blokeeritud, väheneb toote voolukiirus, mis mõjutab saagist. Seetõttu on selliste membraanide valik, mille omadused ja pooride suurus vastavad töödeldud toodete vajadustele, oluliseks teguriks, kas nanomembraanfiltratsiooniga saab viirusi eemaldada.

 

3. Arutelu

Vereallika kvaliteedi tagamise eeldusel on viiruse inaktiveerimise ja eemaldamise protsess oluline ja vajalik vahend veretoodete ohutuse tagamiseks. Ainult ühe inaktiveeritud viirusprotsessi kasutamine ei saa absoluutselt tagada veretoodete ohutust. Viiruse inaktiveerimise tehnoloogia põhjal lisati viiruse eemaldamise tehnoloogia nagu kromatograafia ja nanofilmi filtreerimine, viiruse eemaldamise kiirust suurendati oluliselt ning viiruse inaktiveerimise ja eemaldamise efekti paranes oluliselt. Praegu on Euroopa selgelt välja pakkunud, et veretoodete tootmisprotsessis tuleb veretoodete ohutuse tagamiseks kasutada vähemalt ühte viiruste inaktiveerimist ja eemaldamist.

Hiinas kasutab enamik veretoodete tootjaid tootmisprotsessis ainult ühte inaktiveeritud viiruse protsessi, näiteks Pasteuri desinfitseerimismeetodit, S/D meetodit jne, kuid ei kasuta viiruse eemaldamise protsessi, mis mõjutab tõsiselt veretoodete kvaliteeti. Hiina ühinemisega WTO-ga on kodumaiste veretoodete tootmisprotsess ja kvaliteedistandardid maailmaga kooskõlas, vastasel juhul ei saa see tagada olemasolevat siseturuosa, kuid ei suuda ka konkureerida sarnaste toodetega teistes riikides. rahvusvahelisel turul.

Seetõttu peavad Hiina veretoodete tootjad parandama tootmisprotsessi, tugevdama viiruse inaktiveerimist ja eemaldamist, et tagada toote kvaliteet ja ohutus. Seetõttu on Hiina veretoodete tootjate suundumus veretoodete ohutuse tagamiseks kasutada kromatograafiat veretoodete puhastamiseks ja viiruste eemaldamiseks.

 

Guidlingi kohta

 

Guidling Technology on riiklik kõrgtehnoloogiline ettevõte, mis keskendub biofarmatseutikatele, rakukultuurile, biomeditsiini puhastamisele ja kontsentreerimisele, diagnostikale ja tööstuslikele vedelikele. Oleme edukalt välja töötanud tsentrifugaalfiltriseadmed, ultrafiltreerimis- ja mikrofiltreerimiskassetid, viirusfiltrid, TFF-süsteemid, sügavusfiltrid, õõneskiud jne. Mis vastavad täielikult biofarmatseutiliste preparaatide, rakukultuuri jne rakendusstsenaariumidele. Meie membraane ja membraanfiltreid kasutatakse laialdaselt eelfiltreerimise, mikrofiltreerimise, ultrafiltratsiooni ja nanofiltratsiooni kontsentreerimiseks, ekstraheerimiseks ja eraldamiseks. Meie paljud tootesarjad, alates väikesest ühekordselt kasutatavast laboratoorsest filtreerimisest kuni tootmise filtreerimissüsteemide, steriilsuse testimise, kääritamise, rakukultuuri ja muuni, vastavad testimise ja tootmise vajadustele. Guidling Technology ootab teiega koostööd!